Эндотелий представляет собой динамическую интегрированную структуру, которая играет важную роль во многих физиологических функциях, таких как ангиогенез, гемостаз, воспаление и гомеостаз. Эндотелий также играет важную роль в патофизиологии, такой как атеросклероз, гипертония и диабет. Эндотелиальные клетки образуют внутреннюю оболочку кровеносных и лимфатических сосудов и проявляют гетерогенность в структуре и функциях. Различные группы оценивали функциональность эндотелиальных клеток, полученных из периферической крови человека, уделяя особое внимание эндотелиальным клеткам-предшественникам, полученным из гемопоэтических стволовых клеток или зрелых эндотелиальных клеток крови (или эндотелиальных колониеобразующих клеток). Эти клетки обеспечивают аутологичный ресурс для терапии и моделирования заболеваний. Ксеногенные клетки могут обеспечить альтернативный источник терапевтических средств из-за их доступности и однородности, достигаемой с помощью генетически сходных животных, выращенных в аналогичных условиях. Таким образом, был представлен надежный протокол выделения и расширения эндотелиальных клеток с высоким пролиферативным ростом крови из периферической крови свиней. Эти клетки могут быть использованы для многочисленных применений, таких как сердечно-сосудистая тканевая инженерия, клеточная терапия, моделирование заболеваний, скрининг лекарств, изучение биологии эндотелиальных клеток и совместные культуры in vitro для исследования воспалительных и коагуляционных реакций при ксенотрансплантации.
Эндотелий представляет собой очень сложную, динамичную структуру и жизненно важный компонент сосудистой стенки. Он выстилает внутреннюю поверхность кровеносных сосудов, обеспечивая физический интерфейс между циркулирующей кровью и окружающими тканями. Известно, что эта гетерогенная структура выполняет различные функции, такие как ангиогенез, воспаление, вазорегуляция и гемостаз 1,2,3,4. Эндотелиальные клетки пупочной вены человека являются широко изученным типом клеток для оценки функциональности эндотелиальных клеток. Тем не менее, вариабельность партии для конкретного пациента, непоследовательный фенотип и минимальная эффективность расщепления предполагают необходимость определения источника клеток, который мог бы улучшить все эти особенности5.
Получение однородной популяции первичных эндотелиальных клеток может быть технически сложным, а первичные эндотелиальные клетки не обладают высокой пролиферативной способностью6. Следовательно, для изучения регенерации сосудов и оценки патофизиологических процессов различные группы пытались получить и оценить различные типы эндотелиальных клеток, полученных из периферической крови, например, эндотелиальные клетки-предшественники (EPC) или эндотелиальные клетки роста крови (BOEC)6,7,8,9 . Веретенообразные ранние ЭПК происходят из гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и имеют ограниченную потенциал роста и ограниченную ангиогенную способность продуцировать зрелые эндотелиальные клетки. Кроме того, они очень похожи на воспалительные моноциты. Кроме того, их способность к дальнейшей дифференцировке в функциональные, пролиферирующие, зрелые эндотелиальные клетки все еще остается спорной 6,7,9,10. Непрерывная культура мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) может привести к образованию вторичной популяции клеток, известных как EPC с поздним ростом, BOEC или эндотелиальные колониеобразующие клетки (ECFC)6,7,9,10. Medina et al. в 2018 году признали ограничения EPC, неоднозначность их номенклатуры, а также общее отсутствие соответствия со многими различными типами клеток, постоянно группируемыми под EPC11. Напротив, BOEC получили признание за их роль в восстановлении сосудов, здоровье и болезни, а также клеточную терапию. Дальнейшее изучение и терапевтическое использование этих клеток будет основываться на протоколах для последовательного получения этих типов клеток из циркулирующих клеток-предшественников.
Первичные клетки, такие как BOEC, могут быть использованы в качестве суррогата для получения высокопролиферативных зрелых эндотелиальных клеток6. BOEC фенотипически отличаются от ранних EPC и демонстрируют типичные эндотелиальные особенности, такие как морфология булыжника и экспрессия прилипших соединений и кавеол12. Профилирование генов, проведенное Hebbel et al.13,14,15, показало, что BOEC или ECFC являются истинными эндотелиальными клетками, поскольку они способствуют образованию микрососудов и крупных сосудов. Таким образом, BOEC могут быть использованы в качестве инструмента для оценки патофизиологических процессов и генетической изменчивости16. Они также считаются отличным источником клеток для клеточной терапии для регенерации сосудов17. Следовательно, стандартизированный протокол для последовательного получения этих высокопролиферативных клеток имеет важное значение.
В то время как BOEC предоставляют мощный инструмент для изучения патофизиологических и генетических вариаций человека, более однородный источник BOEC может обеспечить более надежные и надежные экспериментальные и терапевтические результаты. Превосходная однородность может быть достигнута за счет использования ксеногенных клеточных источников, полученных от генетически сходных животных, выращенных в аналогичных условиях18. В то время как ксеногенные клеточные источники склонны вызывать иммунный ответ хозяина, разрабатываются стратегии иммуномодуляции с целью получения иммуносовместимых животных и продуктов животного происхождения, включая клетки. Свиньи, в частности, являются обильным источником периферической крови и обычно используются для изучения медицинских устройств и других методов лечения из-за анатомического и физиологического сходства с людьми. Следовательно, это исследование уточняет протокол выделения и распространения высокопролиферативных BOEC из периферической крови свиней. Протокол, подробно описанный ниже, является простым и надежным методом получения большого количества BOEC из относительно небольшого объема крови. Культуры могут быть расширены через несколько проходов для получения миллионов клеток из одного образца крови.
BOEC являются мощным инструментом, который может быть использован в различных научных и терапевтических подходах 7,8,16. BOEC были использованы для анализа экспрессии гена EC для выяснения ключевых факторов, ответственных за развитие сосуди?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы выразить признательность за финансирование со стороны NIH/NHLBI R00 HL129068.
19 G needle | Covidien | 1188818112 | |
50 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
6 well plate | BD Falcon | 353046 | |
60 mL syringes | Covidien | 8881560125 | |
Ammonium chloride solution (0.8%) | Stemcell Technologies | 07850 | |
Antibiotic/antimycotic solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75-253-839 | |
EGM-2 culture medium | Lonza Walkersville | CC-3162 | |
Extension tube | Hanna Pharmaceutical Supply Co. | 03382C6227 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
Ficoll-Paque 1077 | Cytiva | 17144003 | Density gradient solution |
Heparin sodium injection (1,000 units/mL) | Pfizer | 00069-0058-01 | |
Human plasma fibronectin | Gibco | 33016-015 | |
Ice | N/A | N/A | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
Pipette set | Eppendorf | 2231300004 | |
Sterile water | Gibco | 15230-162 | |
Thin pipette | Celltreat Scientific | 229280 |