Entrega de drogas baseada em bomba osmótica para pesquisa de remyelination in vivo sobre o sistema nervoso central

Summary

A desmielinização ocorre em múltiplas doenças do sistema nervoso central. Uma técnica confiável de entrega de medicamentos in vivo é necessária para remyeliar testes de drogas. Este protocolo descreve um método baseado em bomba osmótica que permite a entrega de drogas a longo prazo diretamente no parenchyma cerebral e melhora a biodisponibilidade da droga, com ampla aplicação em pesquisas de remyelination.

Abstract

A desmielinização foi identificada não apenas na esclerose múltipla (EM), mas também em outras doenças do sistema nervoso central, como a doença de Alzheimer e o autismo. Como as evidências sugerem que a remyelination pode efetivamente amenizar os sintomas da doença, há um foco crescente no desenvolvimento de medicamentos para promover o processo de regeneração da mielina. Assim, é necessária uma técnica de entrega de medicamentos selecionável e confiável para resultados para testar a eficiência e especificidade desses medicamentos in vivo. Este protocolo introduz o implante da bomba osmótica como uma nova abordagem de entrega de drogas no modelo de rato de desmielinização induzido por lisecitina. A bomba osmótica é um pequeno dispositivo implantável que pode contornar a barreira hemencefálica (BBB) e entregar drogas de forma constante e direta para áreas específicas do cérebro do camundongo. Também pode melhorar efetivamente a biodisponibilidade de drogas como peptídeos e proteínas com uma meia-vida curta. Portanto, este método é de grande valor para o campo da pesquisa de regeneração de mielina do sistema nervoso central.

Introduction

A bomba osmótica é um pequeno dispositivo implantável de liberação de soluções. Pode ser usado para parto sistêmico quando implantado subcutâneamente ou na cavidade abdominal. A superfície da bomba osmótica é uma membrana semi-permeável, e seu lado interno é uma camada permeável. A bomba osmótica opera usando a diferença de pressão osmótica entre a camada osmótica e o ambiente tecidual onde a bomba é implantada. A alta osmolalidade da camada osmótica faz com que a água do tecido flua para a camada osmótica através da membrana semi-permeável na superfície da bomba. A camada osmótica expande e comprime o reservatório flexível dentro da bomba, deslocando assim a solução do reservatório flexível a uma determinada taxa por uma longa duração¹. A bomba possui três volumes diferentes de reservatório, 100 μL, 200 μL e 2 mL, com suas taxas de entrega variando de 0,11 μL/h a 10 μL/h. Dependendo do tipo de bomba selecionada, o dispositivo pode operar de 1 dia a 6 semanas². Neste protocolo, é utilizada uma bomba osmótica de 100 μL com uma taxa de transferência de 0,25 μL/h que pode operar por 14 dias.

Na década de 1970, a bomba osmótica tinha sido usada em pesquisas de neurociência ^3,4. Por exemplo, Wei et al. adotaram a abordagem da bomba osmótica para injetar peptídeos opioides no ventrículo em um estudo sobre o vício em drogas³. Após a melhoria contínua, a bomba osmótica tem sido usada agora no estudo da entrega controlada de milhares de drogas, incluindo peptídeos, fatores de crescimento, drogas viciantes, hormônios, esteroides, anticorpos, e assim por diante. Além disso, com cateteres especiais (Kits de Infusão Cerebral) ligados, pode ser usado para infusão direcionada a tecidos ou órgãos específicos, incluindo a medula espinhal, cérebro, baço e fígado ^5,6,7.

No estudo da remielinação, muitas drogas têm sido demonstradas para promover a regeneração da mielina in vitro, mas a maioria deles não tem alcançado efeitos significativos in vivo, possivelmente devido à falta de um método de administração adequado. Métodos tradicionais de administração, como injeção intraperitoneal, injeção subcutânea e administração intragástrica têm limitações na biodisponibilidade dos medicamentos. Além disso, algumas drogas têm má permeabilidade da barreira hematoencefálica, o que prejudica seu acesso ao parênquim cerebral. Juntas, essas limitações exigem um novo método de entrega eficiente. Em combinação com os kits de infusão cerebral, as bombas osmóticas podem contornar a barreira hematoencefálica e entregar drogas diretamente ao corpo caloso, o que efetivamente melhora a biodisponibilidade de drogas, especialmente para alguns polipeptídeos e drogas proteicas com uma meia-vida curta. Portanto, a bomba osmótica como uma nova técnica de entrega de drogas é de grande valor para o campo da pesquisa de regeneração de mielina do sistema nervoso central. A aplicação desta técnica será introduzida em detalhes abaixo.

Protocol

Todos os procedimentos animais foram conduzidos sob diretrizes institucionais e protocolos aprovados pelo comitê de bem-estar animal e ética da Terceira Universidade Médica Militar. 1. Estabelecimento do modelo de rato de desmielinização induzido por lysolecithin Prepare 1% de solução de lisecirina (também chamada de L-α-Lysophosphatidylcholine) com PBS estéril. Esterilizar tesouras, fórceps, hemostat curvo e outros instrumentos cirúrgicos por e…

Representative Results

Para verificar o efeito da bomba osmótica na pesquisa de regeneração de mielina, um modelo de desmielinização induzido por lisolecithin foi criado em camundongos P56, seguido pela implantação de bombas osmóticas contendo UM206 (1 mg em 1,5 mL 0,9% salino), um peptídeo com uma meia-vida curta e má permeabilidade BBB que foi recentemente relatado para promover a remielinização10 . 0,9% salino foi usado como controle. Quatorze dias após o estabelecimento do modelo, os camundongos foram t…

Discussion

Este protocolo descreve a bomba osmótica como uma nova técnica de entrega de medicamentos para a pesquisa de regeneração de mielina, que pode fornecer medicamentos diretamente ao local de tratamento e permitir a entrega consistente de medicamentos por um período prolongado, criando uma concentração estável de drogas no microambiente do sistema nervoso central em toda a duração experimental. Em comparação com outros métodos de entrega de medicamentos, a bomba osmótica é mais propícia para manter a concentr…

Materials

Anesthesia Air Pump	RWD	R510-29	E05818-006
Brain Infusion kit 3	ALZET	0008851	1-3 mm
Carprofen	Macklin	C830557-1g	5 mg/kg every 24 h
Erythromycin eye ointment	Along technology	YCKJ-RJ-024780	Cover the surface of the eyeballs during anesthesia
Erythromycin ointment	pythonbio	RG180
Gas Evacuation Apparatus	RWD	R546W	E05518-002
L-α-Lysophosphatidylcholine	Sigma	L0906	Dissolve at 1% with sterile PBS
Microliter Syringe	Hamilton	65460-05	Syringe Series:1700, 10 µL, 33 gauge
Micro-smotic pump model 1002	ALZET	0004317	0.25 µL per hour, 14 days
PBS (pH = 7.3)	ORIGENE	ZLI-9061
Pentobarbital sodium	Shanghai Civi	CAS NO: 57-33-0	150-200 mg/kg intraperitoneal injection for euthanasia
Small Animal Anesthesia Machine	RWD	R520IE	E05807-006 M
Stereotaxic Equipment	RWD	E06382
STERI 250 sterilizer	Keller	31101	Rapid sterilization of surgical instruments
Surgical sutures	Shanghai jinhuan	F504	5-0
Syringe needle (1 mL)	Shanghai KDL	6930197811018	26 gauge (0.45 mm x 16 mm)
Testing drug and solvent	Experiment dependent	N/A
ThermoStar Homeothermic Monitoring System	RWD	69026	Maintain body temperature during anesthesia
Vetbond Tissue adhesive	3M	1469SB	Secure the brain infusion cannula , Adhere the skin incision