Osmotisk pumpebaseret lægemiddellevering til In Vivo-remyelineringsforskning på centralnervesystemet

Summary

Demyelination finder sted i flere sygdomme i centralnervesystemet. En pålidelig de vivo-lægemiddelleveringsteknik er nødvendig for at remyelinere lægemiddeltest. Denne protokol beskriver en osmotisk pumpebaseret metode, der muliggør langsigtet lægemiddelafgivelse direkte ind i hjernens parenkym og forbedrer lægemidlets biotilgængelighed med bred anvendelse i remyelineringsforskning.

Abstract

Demyelination er blevet identificeret i ikke kun multipel sklerose (MS), men også andre sygdomme i centralnervesystemet som Alzheimers sygdom og autisme. Da beviser tyder på, at remyelinering effektivt kan forbedre sygdomssymptomerne, er der et stigende fokus på lægemiddeludvikling for at fremme myelinregenereringsprocessen. Således kræves en region-valgbar og resultat-pålidelig lægemiddelleveringsteknik for at teste effektiviteten og specificiteten af disse lægemidler in vivo. Denne protokol introducerer det osmotiske pumpeimplantat som en ny lægemiddelleveringsmetode i lysolecithin-induceret demyelinationsmusemodel. Den osmotiske pumpe er en lille implanterbar enhed, der kan omgå blod-hjerne-barrieren (BBB) og levere lægemidler støt og direkte til bestemte områder af musehjernen. Det kan også effektivt forbedre biotilgængeligheden af lægemidler som peptider og proteiner med en kort halveringstid. Derfor er denne metode af stor værdi for området myelinregenereringsforskning i centralnervesystemet.

Introduction

Den osmotiske pumpe er en lille implanterbar opløsningsfrigørende enhed. Det kan bruges til systemisk levering, når det implanteres subkutant eller i bukhulen. Overfladen af den osmotiske pumpe er en semi-permeabel membran, og dens indre side er et gennemtrængeligt lag. Den osmotiske pumpe fungerer ved hjælp af den osmotiske trykforskel mellem det osmotiske lag og vævsmiljøet, hvor pumpen implanteres. Det osmotiske lags høje osmolalitet får vandet i vævet til at strømme ind i det osmotiske lag gennem den semipermeable membran på pumpeoverfladen. Det osmotiske lag udvider og komprimerer det fleksible reservoir inde i pumpen og derved fortrænger opløsningen fra det fleksible reservoir med en vis hastighed i lang tid¹. Pumpen har tre forskellige reservoirvolumener, 100 μL, 200 μL og 2 ml, hvor leveringshastighederne varierer fra 0,11 μL/h til 10 μL/h. Afhængigt af den valgte pumpetype kan enheden fungere fra 1 dag til 6 uger². I denne protokol anvendes en 100 μL osmotisk pumpe med en overførselshastighed på 0,25 μL / h, der kan fungere i 14 dage.

Tilbage i 1970’erne var den osmotiske pumpe blevet brugt i neurovidenskabelig forskning ^3,4. For eksempel vedtog Wei et al. den osmotiske pumpetilgang til at injicere opioidpeptider i ventriklen i en undersøgelse af stofmisbrug³. Efter løbende forbedring er den osmotiske pumpe nu blevet brugt i undersøgelsen af den kontrollerede levering af tusindvis af lægemidler, herunder peptider, vækstfaktorer, vanedannende stoffer, hormoner, steroider, antistoffer og så videre. Derudover kan det med specielle katetre (Brain Infusion Kits) vedhæftet bruges til målrettet infusion til specifikke væv eller organer, herunder rygmarv, hjerne, milt og lever ^5,6,7.

I undersøgelsen af remyelinering har mange lægemidler vist sig at fremme myelinregenerering in vitro, men de fleste af dem har ikke opnået signifikante virkninger in vivo, muligvis på grund af manglen på en passende administrationsmetode. Traditionelle administrationsmetoder såsom intraperitoneal injektion, subkutan injektion og intragastrisk administration har begrænsninger i biotilgængeligheden af lægemidlerne. Derudover har nogle lægemidler dårlig blod-hjerne barrierepermeabilitet, hvilket underminerer deres adgang til hjernens parenchyma. Tilsammen kræver disse begrænsninger en ny effektiv leveringsmetode. I kombination med hjerneinfusionssættene kan osmotiske pumper omgå blod-hjerne-barrieren og levere lægemidler direkte til corpus callosum, hvilket effektivt forbedrer biotilgængeligheden af lægemidler, især for nogle polypeptid- og proteinlægemidler med en kort halveringstid. Derfor er den osmotiske pumpe som en ny lægemiddelleveringsteknik af stor værdi for myelinregenereringsforskningen i centralnervesystemet. Anvendelsen af denne teknik vil blive introduceret i detaljer nedenfor.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført under institutionelle retningslinjer og protokoller godkendt af dyrevelfærds- og etisk komité ved det tredje militærmedicinske universitet. 1. Etablering af den lysolecithin-inducerede demyelinationsmusemodel Forbered 1% lysolecithin (også kaldet L-α-Lysophosphatidylcholin) opløsning med steril PBS. Steriliser saks, tang, buet hæmostat og andre kirurgiske instrumenter ved autoklavestilisering. Steriliser det kirurgiske o…

Representative Results

For at verificere effekten af den osmotiske pumpe i myelinregenereringsforskning blev der oprettet en lysolecithin-induceret demyelinationsmodel i P56-mus efterfulgt af implantation af osmotiske pumper indeholdende UM206 (1 mg i 1,5 ml 0,9% saltvand), et peptid med en kort halveringstid og dårlig BBB-permeabilitet, der for nylig er blevet rapporteret for at fremme remyelinering10 . 0,9% saltvand blev brugt som kontrol. Fjorten dage efter modeletableringen blev mus transkardielt perfunderet med 4%…

Discussion

Denne protokol beskriver den osmotiske pumpe som en ny lægemiddelleveringsteknik til myelinregenereringsforskning, som kan levere lægemidler direkte til behandlingsstedet og muliggøre konsekvent lægemiddellevering i en længere periode, hvilket skaber en stabil lægemiddelkoncentration i mikromiljøet i centralnervesystemet i hele forsøgsvarigheden. Sammenlignet med andre lægemiddelleveringsmetoder er den osmotiske pumpe mere befordrende for at opretholde lægemiddelkoncentrationen i demyelinationslæsionen<sup cla…

Materials

Anesthesia Air Pump	RWD	R510-29	E05818-006
Brain Infusion kit 3	ALZET	0008851	1-3 mm
Carprofen	Macklin	C830557-1g	5 mg/kg every 24 h
Erythromycin eye ointment	Along technology	YCKJ-RJ-024780	Cover the surface of the eyeballs during anesthesia
Erythromycin ointment	pythonbio	RG180
Gas Evacuation Apparatus	RWD	R546W	E05518-002
L-α-Lysophosphatidylcholine	Sigma	L0906	Dissolve at 1% with sterile PBS
Microliter Syringe	Hamilton	65460-05	Syringe Series:1700, 10 µL, 33 gauge
Micro-smotic pump model 1002	ALZET	0004317	0.25 µL per hour, 14 days
PBS (pH = 7.3)	ORIGENE	ZLI-9061
Pentobarbital sodium	Shanghai Civi	CAS NO: 57-33-0	150-200 mg/kg intraperitoneal injection for euthanasia
Small Animal Anesthesia Machine	RWD	R520IE	E05807-006 M
Stereotaxic Equipment	RWD	E06382
STERI 250 sterilizer	Keller	31101	Rapid sterilization of surgical instruments
Surgical sutures	Shanghai jinhuan	F504	5-0
Syringe needle (1 mL)	Shanghai KDL	6930197811018	26 gauge (0.45 mm x 16 mm)
Testing drug and solvent	Experiment dependent	N/A
ThermoStar Homeothermic Monitoring System	RWD	69026	Maintain body temperature during anesthesia
Vetbond Tissue adhesive	3M	1469SB	Secure the brain infusion cannula , Adhere the skin incision