中枢神経系の In Vivo 髄鞘再形成研究のための浸透圧ポンプベースの薬物送達

Summary

脱髄は、複数の中枢神経系疾患において起こる。信頼性の高い インビボ 薬物送達技術は、薬物試験を再髄するために必要である。このプロトコルは、脳実質への長期的な薬物送達を直接可能にし、薬物バイオアベイラビリティを改善し、髄鞘再形成研究に広く適用する浸透圧ポンプベースの方法を記述している。

Abstract

脱髄は、多発性硬化症(MS)だけでなく、アルツハイマー病や自閉症などの他の中枢神経系疾患でも確認されています。髄鞘再形成が疾患症状を効果的に改善できることを示唆する証拠として、ミエリン再生プロセスを促進するための薬物開発への関心が高まっている。したがって、 インビボでこれらの薬物の効率および特異性を試験するためには、領域選択可能で結果的に信頼性の高い薬物送達技術が必要である。このプロトコールは、リゾレシチン誘導脱髄マウスモデルにおける新しい薬物送達アプローチとして浸透圧ポンプインプラントを導入する。浸透圧ポンプは、血液脳関門(BBB)をバイパスし、マウス脳の特定の領域に薬物を着実に直接送達することができる小型の埋め込み型装置である。また、半減期が短いペプチドやタンパク質などの薬物の生物学的利用能を効果的に改善することもできます。したがって、この方法は、中枢神経系ミエリン再生研究の分野にとって大きな価値がある。

Introduction

浸透圧ポンプは、小型の埋め込み型溶液放出装置です。これは、皮下または腹腔内に移植された場合の全身送達に使用することができる。浸透圧ポンプの表面は半透膜であり、その内側は透過層である。浸透圧ポンプは、浸透層とポンプが注入される組織環境との間の浸透圧差を利用して動作する。浸透層の高い浸透圧は、組織内の水をポンプ表面上の半透膜を介して浸透層に流入させる。浸透層は、ポンプ内の可撓性リザーバを膨張および圧縮し、それによって、可撓性リザーバから溶液を一定の速度で長期間にわたって変位させる¹。ポンプには、100 μL、200 μL、および 2 mL の 3 つの異なるリザーバ容量があり、その送達速度は 0.11 μL/h から 10 μL/h までさまざまです。選択したポンプタイプに応じて、装置は1日から6週間²まで動作することができます。このプロトコルでは、14日間動作できる0.25μL/hの転送速度の100μL浸透圧ポンプが使用されます。

1970年代には、浸透圧ポンプは神経科学研究で使用されていました^3,4。例えば、Weiらは、薬物中毒の研究において、オピオイドペプチドを心室に注入するために浸透圧ポンプアプローチを採用した³。継続的な改善の後、浸透圧ポンプは現在、ペプチド、成長因子、中毒性薬物、ホルモン、ステロイド、抗体などを含む何千もの薬物の制御された送達の研究に使用されています。さらに、特別なカテーテル(脳注入キット)が取り付けられているため、脊髄、脳、脾臓、肝臓を含む特定の組織または臓器への標的注入に使用できます^5,6,7。

髄鞘再形成の研究において、多くの薬物がインビ トロでミエリン再生を促進することが示されているが、それらのほとんどは、おそらく適切な投与方法の欠如のために、 インビボで有意な効果を達成していない。腹腔内注射、皮下注射、および胃内投与などの従来の投与方法は、薬物の生物学的利用能に限界がある。さらに、いくつかの薬物は血液脳関門透過性が悪く、脳実質へのアクセスを損なう。これらの制限が組み合わさって、新しい効率的な配信方法が必要になります。脳注入キットと組み合わせて、浸透圧ポンプは血液脳関門をバイパスし、脳梁に直接薬物を送達することができ、これは薬物の生物学的利用能、特に半減期の短いポリペプチドおよびタンパク質薬物に対して効果的に改善する。従って、新たなドラッグデリバリー技術としての浸透圧ポンプは、中枢神経系ミエリン再生研究の分野において大きな価値がある。この手法の応用については、以下で詳しく紹介する。

Protocol

すべての動物の手続きは、第三軍事医科大学の動物福祉倫理委員会によって承認された制度的ガイドラインとプロトコルの下で実施されました。 リゾレシチン誘導脱髄マウスモデルの確立 滅菌PBSで1%リゾレシチン(L-α-リゾホスファチジルコリンとも呼ばれる)溶液を調製する。 はさみ、鉗子、湾曲した止血器、その他の手術器具をオートクレ?…

Representative Results

ミエリン再生研究における浸透圧ポンプの効果を検証するために、P56マウスにおいてリゾレシチン誘導脱髄モデルを作成し、続いてUM206(1.5mL中1mg、0.9%生理食塩水中1mg)、半減期が短くBBB透過性が悪いペプチドを含む浸透圧ポンプを移植し、髄鞘再形成を促進することが最近報告されている10.9%生理食塩水を対照として用いた。モデル確立の14日後、マウスを4%ホルムアルデヒド…

Discussion

このプロトコルは、浸透圧ポンプをミエリン再生研究のための新しい薬物送達技術として記述し、薬物を治療部位に直接送達し、長期間にわたって一貫した薬物送達を可能にし、実験期間全体において中枢神経系の微小環境において安定した薬物濃度を作り出すことができる。他の薬物送達方法と比較して、浸透圧ポンプは、脱髄病変¹³における薬物濃度の維持をより有益?…

Materials

Anesthesia Air Pump	RWD	R510-29	E05818-006
Brain Infusion kit 3	ALZET	0008851	1-3 mm
Carprofen	Macklin	C830557-1g	5 mg/kg every 24 h
Erythromycin eye ointment	Along technology	YCKJ-RJ-024780	Cover the surface of the eyeballs during anesthesia
Erythromycin ointment	pythonbio	RG180
Gas Evacuation Apparatus	RWD	R546W	E05518-002
L-α-Lysophosphatidylcholine	Sigma	L0906	Dissolve at 1% with sterile PBS
Microliter Syringe	Hamilton	65460-05	Syringe Series:1700, 10 µL, 33 gauge
Micro-smotic pump model 1002	ALZET	0004317	0.25 µL per hour, 14 days
PBS (pH = 7.3)	ORIGENE	ZLI-9061
Pentobarbital sodium	Shanghai Civi	CAS NO: 57-33-0	150-200 mg/kg intraperitoneal injection for euthanasia
Small Animal Anesthesia Machine	RWD	R520IE	E05807-006 M
Stereotaxic Equipment	RWD	E06382
STERI 250 sterilizer	Keller	31101	Rapid sterilization of surgical instruments
Surgical sutures	Shanghai jinhuan	F504	5-0
Syringe needle (1 mL)	Shanghai KDL	6930197811018	26 gauge (0.45 mm x 16 mm)
Testing drug and solvent	Experiment dependent	N/A
ThermoStar Homeothermic Monitoring System	RWD	69026	Maintain body temperature during anesthesia
Vetbond Tissue adhesive	3M	1469SB	Secure the brain infusion cannula , Adhere the skin incision