Langendorff 준비에서 신생아 뮤린 하트의 사용을위한 수정 된 기술
Summary
본 프로토콜은 생체외 신생아 뮤린 심장의 대동맥 캐뉼레이션 및 역행 관류를 기술한다. 해부 현미경과 무딘 작은 게이지 바늘을 사용하는 두 사람 전략은 신뢰할 수있는 통조림을 허용합니다. 종방향 수축 장력의 정량화는 좌심실의 정점에 연결된 힘 변환기를 사용하여 달성된다.
Abstract
생체외 역행 관류 심장의 사용은 한 세기 전에 오스카 랑겐도르프에 의해 개발 된 이래로 허혈 재관류 조사의 초석이었습니다. 이 기술은 지난 25 년 동안 마우스에 적용되었지만,이 종에서의 사용은 성인 동물로 제한되었습니다. 신생아 뮤린 대동맥을 지속적으로 캐뉼레이트하는 성공적인 방법의 개발은 유전자 변형 가능하고 저렴한 종에서 심장 발달의 중요 기간 동안 고립 된 역행 용혈 심장에 대한 체계적인 연구를 가능하게합니다. Langendorff 제제의 수정은 허혈성 시간을 최소화하면서 신생아 뮤린 심장에서 재관류의 정식 및 확립을 가능하게합니다. 최적화를 위해서는 해부 현미경 및 변형된 상업적으로 이용가능한 바늘을 사용하여 신생아 마우스 대동맥의 성공적인 캐뉼레이션을 허용하기 위해 두 사람 기술이 필요합니다. 이 접근법의 사용은 3 분 이내에 역행 관류를 안정적으로 확립 할 것입니다. 신생아 마우스 심장의 취약성과 심실 공동 크기는 풍선을 사용하여 발생하는 심실 내 압력의 직접적인 측정을 방해하기 때문에 봉합사에 의해 좌심실의 정점에 연결된 힘 변환기를 사용하여 종방향 수축 장력을 정량화해야합니다. 이 방법을 통해 조사관은 격리 된 정수 흐름 역행 – 관류 된 신생아 뮤린 심장 준비를 성공적으로 확립하여 생체 외 방식으로 발달 심장 생물학을 연구 할 수 있습니다. 중요하게도, 이 모델은 신생아 심장에서 허혈-재관류에 대한 생리학적 및 약리학적 반응을 조사하는 강력한 도구가 될 것이다.
Introduction
생체 외 심장 제제는 한 세기 이상 생리, 병리 생리학 및 약리학 연구의 필수품이었습니다. 1860년대 엘리아스 시온(Elias Cion)의 연구에서 비롯된 오스카 랑겐도르프(Oskar Langendorff)는 역행 관류를 위해 분리된 개구리 모델을 채택하여 대동맥 뿌리에 압력을 가하여 산소화된 향수1로 관상동맥 흐름을 제공했다. 그의 적응을 사용하여, Langendorff는 관상 동맥 순환과 기계적 기능 사이의 상관 관계를 입증 할 수있었습니다2. 나중에 Langendorff 기법이라고 불리는 생체 외 역행 관류 된 심장은 생리 학적 조사의 초석으로 남아 있으며, 잠재적 인 혼란이없는 상태에서 고립 된 심장을 강력하게 연구하기 위해 단순성을 활용했습니다. Langendorff 준비는 심장이 배출 될 수 있도록 (소위 “일하는 심장”이라고 함)을 허용하고 향수가 재순환 할 수 있도록 추가로 수정되었습니다3. 그러나 관심의 주요 생리 학적 종점은 변하지 않았습니다. 이러한 종점에는 수축 기능, 전기 전도, 심장 대사 및 관상 동맥 저항의 측정이 포함됩니다 4.
원래 개구리 심장 준비에서 심장 기능을 평가하기 위해 Langendorff는 심장의 정점과 힘 변환기 사이에 연결된 봉합사를 사용하여 종축에서 심실 수축에 의해 생성 된 긴장을 측정했습니다. 5 등각 수축은 심실 충전이 없을 때 심장에 가해지는 기저 긴장으로 이러한 방식으로 정량화되었습니다. 접근법의 개선은 등공 수축 동안 심근 성능을 평가하기 위해 좌심방을 통해 좌심실에 유체로 채워진 풍선을 배치하게했다6. 심장 리듬과 심박수를 평가하기 위해 표면 리드를 심장의 극에 배치하여 조사관이 심전도를 기록 할 수 있도록합니다. 그러나 의무적 인 거부를 감안할 때 상대적 서맥을 기대할 수 있습니다. 외인성 페이싱은 이를 극복하고 실험1 사이의 심박수 변동성을 제거하는 역할을 할 수 있다. 또 다른 결과 측정, 심근 대사는 관상 동맥 향수 및 유출물의 산소 및 대사 기질 함량을 측정하고 그 차이를 계산하여 평가할 수 있습니다7. 관상 동맥 유출물에서의 젖산 정량화는 저산소증, 저관류, 허혈 재관류 또는 대사 교란으로 보이는 바와 같이 혐기성 대사 기간을 특성화하는 데 도움이 될 수 있습니다7.
Langendorff의 독창적 인 연구는 고양이를 주요 주제로 사용하여 생체 외 포유류 심장에 대한 연구를 가능하게했습니다5. 고립 된 쥐 심장에 대한 평가는 1900 년대 중반에 하워드 모건 (Howard Morgan)과 함께 인기를 얻었으며, 하워드 모건 (Howard Morgan)은 1967년 5 년에 ‘일하는 마음’쥐 모델을 자세히 설명했습니다. 마우스의 사용은 기술적 복잡성, 조직 취약성 및 상대적으로 작은 뮤린 심장 크기 때문에 25 년 전에 시작되었습니다. 마우스 연구와 관련된 도전에도 불구하고, 유전자 조작의 더 낮은 비용 및 용이성은 이러한 뮤린 생체외 제제의 호소 및 수요를 증가시켰다. 불행히도이 기술의 적용은 성인 동물로 제한되었으며, 4 주령의 어린 마우스는 아주 최근까지 생체 외 연구에 활용 된 가장 어린 피험자였습니다 8,9. 청소년 생쥐는 성인에 비해 “상대적으로 미성숙”하지만, 발달 생물학 연구의 대상으로서의 유용성은 출생 댐에서 젖을 떼고 곧 사춘기10을 시작할 것이기 때문에 제한적입니다. 청소년기는 포도당과 젖산에서 지방산11로 심근 기질 이용에서 출생 후 전이를 훨씬 넘어서 발생합니다. 따라서, 신생아 심장의 대사 변화에 대한 대부분의 정보는 역사적으로 토끼 및 기니피그(11)와 같은 더 큰 종에서의 생체외 작용으로부터 기인한다.
실제로 Langendorff 준비에 대한 대안적인 접근법이 존재합니다. 여기에는 전체 장기 기능 데이터 및 문맥이 결여된 시험관내 실험 또는 생체내 연구가 포함된다. 이것은 필수 마취제의 심혈관 및 호흡 효과, 신경 체액성 입력의 영향, 핵심 온도의 결과, 동물의 영양 상태 및 기질 가용성12,13과 같은 혼란스러운 변수로 인해 기술적으로 도전적이고 복잡 할 수 있습니다. Langendorff 접근법은 그러한 혼란스러움이없는 경우보다 통제 된 방식으로 생체 외 방식으로 격리 된 관류 된 심장에 대한 연구를 허용하기 때문에 강력한 조사 도구로 간주되어 왔으며 앞으로도 계속되고 있습니다. 따라서 여기에 제시된 기술은 연구자들에게 신생아 뮤린 심장의 생체 외 연구를위한 실험적 접근법을 제공하고 재관류 시간을 제한합니다.
발달 기간 동안 심장을 조사하는 것은 심근 성숙 중에 발생하는 광범위한 생화학적, 생리적 및 해부학 적 전이를 고려할 때 중요한 고려 사항입니다. 혐기성 대사에서 산화적 인산화로의 이동, 기질 이용의 변화, 세포 증식에서 비대로의 진행은 미성숙 심장에서 유일하게 발생하는 역동적인 과정이다(11,14). 발달하는 심장의 또 다른 중요한 측면은 필요한 기간 동안 직면 한 스트레스 요인이 신생아 심장에서 더 높은 반응을 일으키고 성인기의 모욕에 대한 미래의 감수성을 변화시킬 수 있다는 것입니다15. 이전 연구는 Langendorff가 관류 된 신생아 심장을 연구하기 위해 신생아 쥐, 양 및 토끼를 활용했지만,이 종의 발달 생물학 연구16의 중요성을 감안할 때 생쥐 사용을 허용하는 진보가 필요합니다. 이러한 요구를 해결하기 위해, 10 일 된 동물을 사용하는 최초의 뮤린 Langendorff-perfused 신생아 심장 모델이 최근에 확립되었습니다6. 여기에 제시된 것은 성공적인 대동맥 절개술을 가능하게하고 고립 된 신생아 뮤린 심장의 역행 관류를 확립하는 방법입니다. 이러한 접근법은 약리학, 허혈-재관류, 또는 전체 기관 기능에 초점을 맞춘 대사 연구에 활용될 수 있거나, 심근세포의 단리를 위해 적응될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 연구는 고립 된 신생아 마우스 심장에서 성공적인 대동맥 통조림과 역행 관류를 설명합니다. 중요한 것은 연구자들이 젊은 뮤린 나이와 작은 심장 크기가 이전에 제시 한 장벽을 극복 할 수있게 해줍니다8. 설계가 복잡하지는 않지만 상당한 수준의 기술 기술이 필요합니다. 가장 기술적으로 능숙한 조사관조차도 필연적으로 도전 할 핵심 단계는 대동맥을 캐뉼레이션하고 캐?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH/NINDS R01NS112706 (R.L.)
Materials
| Rodent Langendorff Apparatus | Radnoti | 130102EZ | |
| 24 G catheter | BD | 381511 | |
| 26 G needle on 1 mL syringe combo | BD | 309597 | |
| 26 G steel needle | BD | 305111 | |
| 5-0 Silk Suture | Ethicon | S1173 | |
| Bio Amp | ADInstruments | FE135 | |
| Bio Cable | ADInstruments | MLA1515 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901-100G | |
| Circulating heating water Bath | Haake | DC10 | |
| curved iris scissor | Medline | MDS10033Z | |
| dissecting microscope | Nikon | SMZ-2B | |
| find spring scissors | Kent | INS600127 | |
| Force Transducer | ADInstruments | MLT1030/D | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| Heparin | Sagent | 400-01 | |
| High pressure tubing | Edwards Lifesciences | 50P184 | |
| iris dressing forceps | Kent | INS650915-4 | |
| Jeweler-style curved fine forceps | Miltex | 17-307-MLTX | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911-25G | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662-25G | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-25G | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014-25G | |
| Roller Pump | Gilson | Minipuls 3 | |
| straight dissecting scissors | Kent | INS600393-G | |
| Temporary cardiac pacing wire | Ethicon | TPW30 | |
| Wide Range Force Transducer | ADInstruments | MLT1030/A |
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