Técnica modificada para o uso de corações murinos neonatais na preparação de Langendorff

Summary

O presente protocolo descreve a canonização aórtica e a perfusão retrógrada do coração murino neonatal ex-vivo . Uma estratégia de duas pessoas, usando um microscópio de dissecação e uma agulha de bitola pequena, permite a cannulação confiável. A quantificação da tensão contítil longitudinal é alcançada usando um transdutor de força conectado ao ápice do ventrículo esquerdo.

Abstract

O uso do coração perfumado ex-vivo tem sido uma pedra angular da investigação isquemia-reperfusão desde o seu desenvolvimento por Oskar Langendorff há mais de um século. Embora essa técnica tenha sido aplicada a camundongos nos últimos 25 anos, seu uso nesta espécie tem sido limitado a animais adultos. O desenvolvimento de um método bem-sucedido para cannular consistentemente a aorta murina neonatal permitiria o estudo sistemático do coração isolado perfusado retrógrado durante um período crítico de desenvolvimento cardíaco em uma espécie geneticamente modificável e de baixo custo. A modificação da preparação de Langendorff permite a canulação e o estabelecimento de reperfusão no coração murino neonatal, minimizando o tempo isquêmico. A otimização requer uma técnica de duas pessoas para permitir a cannulação bem sucedida da aorta do rato recém-nascido usando um microscópio de dissecação e uma agulha modificada comercialmente disponível. O uso desta abordagem estabelecerá de forma confiável a perfusão retrógrada dentro de 3 minutos. Como a fragilidade do coração do camundongo neonatal e o tamanho da cavidade ventricular impedem a medição direta da pressão intraventricular gerada usando um balão, é necessário o uso de um transdutor de força conectado por uma sutura ao ápice do ventrículo esquerdo para quantificar a tensão contratitil longitudinal. Este método permite aos pesquisadores estabelecer com sucesso uma preparação isolada de coração murino de fluxo constante, permitindo o estudo da biologia cardíaca do desenvolvimento de forma ex-vivo . É importante ressaltar que este modelo será uma poderosa ferramenta para investigar as respostas fisiológicas e farmacológicas à isquemia-reperfusão no coração neonatal.

Introduction

Os preparativos do coração ex-vivo têm sido um grampo de estudos fisiológicos, fisiopatológicos e farmacológicos há mais de um século. Decorrente do trabalho de Elias Cyon na década de 1860, Oskar Langendorff adaptou o modelo isolado de sapo para perfusão retrógrada, pressurizando a raiz aórtica para fornecer fluxo coronário com um perfusado oxigenado¹. Usando sua adaptação, Langendorff foi capaz de demonstrar uma correlação entre circulação coronária e função mecânica². O ex-vivo coração retrógrado perfumado, mais tarde homônimo apelidado de técnica Langendorff, tem permanecido uma pedra angular da investigação fisiológica, aproveitando sua simplicidade para estudar poderosamente o coração isolado na ausência de potenciais confundidores. A preparação de Langendorff foi modificada ainda mais para permitir que o coração ejete (o chamado “coração de trabalho”) e permita que o perfusato recircular³. No entanto, os principais pontos de interesse fisiológicos permaneceram inalterados. Tais pontos finais incluem medidas de função contratil, condução elétrica, metabolismo cardíaco e resistência coronariana⁴.

Para avaliar a função cardíaca em sua preparação cardíaca original, Langendorff mediu a tensão gerada pela contração ventricular no eixo longitudinal usando uma sutura conectada entre o ápice do coração e um transdutor de força. ⁵ A contração isométrica foi quantificada desta forma com tensão basal aplicada ao coração na ausência de preenchimento ventricular. O refinamento da abordagem levou a balões cheios de fluidos colocados no ventrículo esquerdo através do átrio esquerdo para avaliar o desempenho do miocárdio durante a contração isovolumica⁶. Para avaliar o ritmo cardíaco e a frequência cardíaca, os condutores de superfície podem ser colocados nos polos do coração para permitir que os investigadores gravem o eletrocardiograma. No entanto, pode-se esperar bradicardia relativa, dada a denervação obrigatória. O ritmo extrínseco pode servir para superar isso e eliminar a variabilidade da frequência cardíaca entre os experimentos¹. Outra medida de desfecho, o metabolismo do miocárdio, pode ser avaliada medindo o teor de oxigênio e substrato metabólico no perfusato coronário e efluente e calculando a diferença entre eles⁷. A quantificação de lactato no efluente coronário pode auxiliar na caracterização de períodos de metabolismo anaeróbico como é visto com hipóxia, hipoperfusão, isquemia-reperfusão ou perturbações metabólicas⁷.

O trabalho original de Langendorff possibilitou o estudo do coração mamífero ex-vivo, usando gatos como tema principal⁵. A avaliação do coração de rato isolado ganhou popularidade em meados da década de 1900 com Howard Morgan, que detalhou o modelo de rato “coração de trabalho” em 1967⁵. O uso de camundongos começou há apenas 25 anos devido à complexidade técnica, fragilidade tecidual e tamanho relativamente pequeno do coração murino. Apesar dos desafios associados ao estudo dos camundongos, os custos mais baixos e a facilidade da manipulação genética aumentaram o apelo e a demanda de tais preparações ex-vivo murinas. Infelizmente, a aplicação da técnica tem sido limitada a animais adultos, com camundongos juvenis de 4 semanas de idade sendo os mais jovens utilizados para o estudo ex-vivo até recentemente ^8,9. Embora os camundongos juvenis sejam “relativamente imaturos” em comparação com os adultos, sua utilidade como sujeitos para estudos de biologia do desenvolvimento é limitada porque eles têm, em geral, desmamado de sua represa de nascimento e em breve começará a puberdade¹⁰. A adolescência ocorre muito além da transição pós-natal na utilização do substrato miocárdio de glicose e lactato para ácidos graxos¹¹. Assim, a maioria das informações sobre as mudanças metabólicas no coração neonatal tem historicamente resultado de trabalhos ex-vivos em espécies maiores, como coelhos e^{cobaias 11}.

De fato, existem abordagens alternativas para a preparação de Langendorff. Estes incluem experimentação in vitro, que carece de dados e contexto funcionais de órgãos inteiros, ou estudos in vivo. Isso pode ser tecnicamente desafiador e complicado confundindo variáveis como os efeitos cardiovasculares e respiratórios de um agente anestésico necessário, a influência da entrada neurohumoral, as consequências da temperatura do núcleo, o estado nutricional do animal e a disponibilidade de^{substratos 12,13}. Como a abordagem de Langendorff permite o estudo do coração isolado perfumado de forma ex-vivo de forma mais controlada na ausência de tais confundimentos, tem sido e continua a ser considerado uma poderosa ferramenta investigativa. Portanto, a técnica aqui apresentada dá aos pesquisadores uma abordagem experimental para o estudo ex-vivo do coração murino recém-nascido e limita o tempo para a reperfusão.

Investigar o coração durante períodos de desenvolvimento é uma consideração importante, dadas as amplas transições bioquímicas, fisiológicas e anatômicas que ocorrem durante o amadurecimento do miocárdio. Mudanças do metabolismo anaeróbico para a fosforilação oxidativa, alterações na utilização do substrato e progressão da proliferação celular para a hipertrofia são processos dinâmicos que ocorrem exclusivamente no coração imaturo^11,14. Outro aspecto crítico do coração em desenvolvimento é que os estressores encontrados durante os períodos necessários podem produzir respostas elevadas no coração recém-nascido e alterar a suscetibilidade futura a insultos na idade adulta¹⁵. Embora o trabalho anterior tenha utilizado ratos, cordeiros e coelhos recém-nascidos para estudar o coração neonatal perfusado de Langendorff, os avanços que permitem o uso de camundongos são necessários dada a importância desta espécie para a pesquisa de biologia do desenvolvimento¹⁶. Para atender a essa necessidade, o primeiro modelo de coração recém-nascido perfusado por Murine Langendorff usando animais de 10 dias de idade foi recentemente estabelecido⁶. Apresentado aqui é um método para permitir a canulação aórtica bem sucedida e estabelecer perfusão retrógrada do coração murino recém-nascido isolado. Essa abordagem pode ser utilizada para farmacologia, isquemia-reperfusão ou estudos de metabolismo com foco em toda a função do órgão ou pode ser adaptada para o isolamento de cardiomiócitos.

Protocol

As aprovações do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro Médico da Universidade de Columbia foram obtidas para todos os métodos descritos. No estudo, foram utilizados 10 camundongos do pós-natal masculino do tipo selvagem 10 camundongos. 1. Preparação do aparelho Langendorff Para minimizar a complexidade, use perfusato oxigenado não recirculante dentro do aparelho Langendorff (ver Tabela de Materiais) através de…

Representative Results

Os ratos P10 foram usados para modelar um ponto de tempo na infância humana26,27. Quinze corações isolados de camundongos C57Bl/6 foram colhidos e culados com sucesso. Corações foram perfundidos com um fluxo contínuo de 2,5 mL min-1 de KHB oxigenado aquecido. Foram medidos parâmetros metabólicos, incluindo extração de glicose, consumo de oxigênio, produção de lactato e parâmetros fisiológicos, como frequência cardíaca, pressão de perf…

Discussion

O presente trabalho descreve a canonização aórtica bem sucedida e a perfusão retrógrada no coração isolado do camundongo recém-nascido. É importante ressaltar que permite aos pesquisadores superar as barreiras que a idade de murina jovem e o pequeno tamanho do coração apresentaram anteriormente⁸. Embora não seja complexa no design, a abordagem requer um grau significativo de habilidade técnica. Os principais passos que inevitavelmente desafiarão até mesmo os investigadores mais tecn…

Materials

Rodent Langendorff Apparatus	Radnoti	130102EZ
24 G catheter	BD	381511
26 G needle on 1 mL syringe combo	BD	309597
26 G steel needle	BD	305111
5-0 Silk Suture	Ethicon	S1173
Bio Amp	ADInstruments	FE135
Bio Cable	ADInstruments	MLA1515
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901-100G
Circulating heating water Bath	Haake	DC10
curved iris scissor	Medline	MDS10033Z
dissecting microscope	Nikon	SMZ-2B
find spring scissors	Kent	INS600127
Force Transducer	ADInstruments	MLT1030/D
glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G
Heparin	Sagent	400-01
High pressure tubing	Edwards Lifesciences	50P184
iris dressing forceps	Kent	INS650915-4
Jeweler-style curved fine forceps	Miltex	17-307-MLTX
KCl	Sigma-Aldrich	P3911-25G
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662-25G
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506-500G
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888-25G
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014-25G
Roller Pump	Gilson	Minipuls 3
straight dissecting scissors	Kent	INS600393-G
Temporary cardiac pacing wire	Ethicon	TPW30
Wide Range Force Transducer	ADInstruments	MLT1030/A