Kvantitativ mikrotubulusfraktioneringsteknik til adskillelse af stabile mikrotubuli, labile mikrotubuli og frit tubulin i musevæv

Summary

Mikrotubuli, som er tubulinpolymerer, spiller en afgørende rolle som cytoskeletkomponent i eukaryote celler og er kendt for deres dynamiske ustabilitet. Denne undersøgelse udviklede en metode til fraktionering af mikrotubuli for at adskille dem i stabile mikrotubuli, labile mikrotubuli og frit tubulin for at evaluere stabiliteten af mikrotubuli i forskellige musevæv.

Abstract

Mikrotubuli, der består af α/β-tubulindimerer, er en afgørende komponent i cytoskelettet i eukaryote celler. Disse rørlignende polymerer udviser dynamisk ustabilitet, da tubulinheterodimerunderenheder gennemgår gentagen polymerisation og depolymerisering. Præcis kontrol af mikrotubulus stabilitet og dynamik, opnået gennem tubulin posttranslationelle modifikationer og mikrotubulus-associerede proteiner, er afgørende for forskellige cellulære funktioner. Dysfunktioner i mikrotubuli er stærkt impliceret i patogenese, herunder neurodegenerative lidelser. Igangværende forskning fokuserer på mikrotubuli-målrettede terapeutiske midler, der modulerer stabilitet, hvilket tilbyder potentielle behandlingsmuligheder for disse sygdomme og kræftformer. Derfor er forståelse af mikrotubulis dynamiske tilstand afgørende for vurdering af sygdomsprogression og terapeutiske virkninger.

Traditionelt er mikrotubulusdynamikken blevet vurderet in vitro eller i dyrkede celler gennem grov fraktionering eller immunoassay ved hjælp af antistoffer rettet mod posttranslationelle modifikationer af tubulin. Imidlertid udgør en nøjagtig analyse af tubulinstatus i væv ved hjælp af sådanne procedurer udfordringer. I denne undersøgelse udviklede vi en enkel og innovativ mikrotubulusfraktioneringsmetode til at adskille stabile mikrotubuli, labile mikrotubuli og frit tubulin i musevæv.

Proceduren involverede homogenisering af dissekeret musevæv i en mikrotubulusstabiliserende buffer i et volumenforhold på 19:1. Homogenaterne blev derefter fraktioneret gennem en to-trins ultracentrifugeringsproces efter indledende langsom centrifugering (2.400 × g) for at fjerne snavs. Det første ultracentrifugeringstrin (100.000 × g) udfældede stabile mikrotubuli, mens den resulterende supernatant blev underkastet et andet ultracentrifugeringstrin (500.000 × g) for at fraktionere labile mikrotubuli og opløselige tubulindimerer. Denne metode bestemte proportionerne af tubulin, der udgør stabile eller labile mikrotubuli i musehjernen. Derudover blev der observeret forskellige vævsvariationer i mikrotubulusstabilitet, der korrelerede med de cellers proliferative kapacitet. Disse resultater fremhæver det betydelige potentiale i denne nye metode til analyse af mikrotubulusstabilitet under fysiologiske og patologiske tilstande.

Introduction

Mikrotubuli (MT’er) er aflange rørformede strukturer bestående af protofilamenter bestående af α/β-tubulin heterodimerunderenheder. De spiller væsentlige roller i forskellige cellulære processer såsom celledeling, motilitet, formvedligeholdelse og intracellulær transport, hvilket gør dem til integrerede komponenter i det eukaryote cytoskelet¹. Minus-enden af MT’er, hvor α-tubulin-underenheden eksponeres, er relativt stabil, mens plus-enden, hvor β-tubulin-underenheden eksponeres, gennemgår dynamisk depolymerisering og polymerisering². Denne kontinuerlige cyklus af tubulindimertilsætning og dissociation i plus-enden, kaldet dynamisk ustabilitet, resulterer i en gentagen proces med redning og katastrofe³. MT’er udviser fokusdomæner med lokaliserede variationer i dynamisk ustabilitet, herunder stabile og labile domæner⁴.

Præcis kontrol af den dynamiske ustabilitet af MT’er er afgørende for adskillige cellulære funktioner, især i neuroner karakteriseret ved indviklede morfologier. MT’ernes tilpasningsevne og holdbarhed spiller en afgørende rolle for nervecellernes udvikling og korrekte funktion ^5,6,7. Den dynamiske ustabilitet af MT’er har vist sig at være forbundet med forskellige posttranslationelle modifikationer (PTM’er) af tubulin, såsom acetylering, phosphorylering, palmitoylering, detyrosinering, delta 2, polyglutaminoxidation og polyglycylering. Derudover tjener bindingen af mikrotubulusassocierede proteiner (MAP’er) som en reguleringsmekanisme⁸. PTM’er, bortset fra acetylering, forekommer overvejende i det tubulincarboxyterminale område beliggende på den ydre overflade af MT’er. Disse ændringer skaber forskellige overfladeforhold på MT’er, påvirker deres interaktion med MAP’er og styrer i sidste ende MT-stabilitet⁹. Tilstedeværelsen af en carboxyterminal tyrosinrest i α-tubulin er tegn på dynamiske MT’er, som hurtigt erstattes af den frie tubulinpulje. Omvendt betyder detyrosinering af carboxyterminalen og acetylering af Lys40 stabile MT’er med reduceret dynamisk ustabilitet ^9,10.

PTM’erne af tubulin er blevet anvendt i vid udstrækning i eksperimenter til at vurdere dynamikken og stabiliteten af MT’er 5,7,11,12,13,14,15. For eksempel kan tubuliner i cellekulturundersøgelser adskilles i to puljer: den frie tubulinpool og MT-poolen. Dette opnås ved at frigive frit tubulin gennem cellepermeabilisering, før de resterende MT’er fikseres 15,16,17,18,19. Biokemiske metoder involverer anvendelse af kemiske MT-stabilisatorer, der beskytter MT’er mod katastrofe, hvilket muliggør adskillelse af MT’er og frit tubulin gennem centrifugering^20,21,22. Disse procedurer skelner imidlertid ikke mellem stabile og mindre stabile (labile) MT’er, hvilket gør det umuligt at kvantificere MT’er eller opløseligt tubulin i væv som hjernen. Derfor har evaluering af MT-stabilitet i organismer under fysiologiske og patologiske forhold vist sig at være udfordrende. For at imødegå denne eksperimentelle begrænsning har vi udviklet en ny teknik til præcis adskillelse af MT’er og frit tubulin i musevæv²³.

Denne unikke MT-fraktioneringsmetode involverer vævshomogenisering under betingelser, der opretholder tubulinstatus i væv og totrinscentrifugering for at adskille stabile MT’er, labile MT’er og frit tubulin. Denne enkle procedure kan anvendes til brede undersøgelser, herunder grundforskning i MT’er og MAP’er i levende organismer, fysiologiske og patologiske analyser af sundhed og sygdomme forbundet med MT-stabilitet og udvikling af lægemidler og andre terapeutiske midler, der er målrettet mod MT’er.

Protocol

1. MT-fraktioneringsmetode BEMÆRK: Alle eksperimenter udført i denne undersøgelse blev godkendt af Animal Ethics Committee of Doshisha University. C57BL/6J mus af begge køn, 3-4 måneder gamle, blev brugt her. I denne protokol blev dissekerede væv, fx hjerne, lever eller thymus, straks homogeniseret i iskold mikrotubulusstabiliserende buffer (MSB), som indeholdt Taxol (MT-stabilisator) i en koncentration, der forhindrede ikke kun depolymerisering, men også repolymerisering…

Representative Results

Kvantificering af tubulin i P2-, P3- og S3-fraktionerne fra musehjerne ved hjælp af MT-fraktioneringsmetodenTubulin i musevæv blev separeret i P2-, P3- og S3-fraktionerne ved MT-fraktioneringsmetoden og kvantificeret ved Western blotting (figur 1A). Bundfaldet af MT’er, der forblev i P2-fraktionen ved ultracentrifugering ved 100.000 × g i 20 minutter, tegnede sig for 34,86% ± 1,68% af det samlede tubulin i en musehjerne. Supernatanten (S2) blev yderligere ce…

Discussion

Den vigtigste opgave ved undersøgelse af tubulins status i væv fra levende organismer er at forhindre utilsigtet MT-polymerisation eller depolymerisering under fremstillingen. Stabiliteten af MT’er i prøver påvirkes af faktorer som koncentrationen af Taxol i MSB, andelen af vævsmængde til buffer og temperatur under processen fra vævsfjernelse til homogenisering og centrifugering. Derfor blev betingelserne optimeret i hvert trin i protokollen til analyse af musevæv med et 20 gange volumen homogenat. En højere kon…

Materials

1.5 ML TUBE CASE OF 500	Beckman Coulter	357448
1A2	Sigma-Aldrich	T9028	1:5,000 dilution
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Nacalai Tesque	02442-44
300 kDa ultrafiltration spin column	Aproscience	PT-1013
6-11B1	Sigma-Aldrich	T7451	1:5,000 dilution
AKTA prime plus	Cytiva
anti-mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-035-146	1:5,000 dilution
antipain	Peptide Institute Inc.	4062
aprotinin	Nacalai Tesque	03346-84
Chemi-Lumi One L	Nacalai Tesque	07880-54
Corning bottle-top vacuum filter system	Corning	430758	0.22µm 33.2cm² Nitrocellulose membrane
DIFP	Sigma-Aldrich	55-91-4
DIGITAL HOMOGENIZER		AS ONE	HOM
DM1A	Sigma-Aldrich	T9026	1:5,000 dilution
DTT	Nacalai Tesque	14128-46
EGTA	Nacalai Tesque	37346-05
FluoroTrans W 3.3 Meter Roll	Pall Corporation	BSP0161
glycerol	Nacalai Tesque	17018-25
GTP		Nacalai Tesque	17450-61
HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman		TOMY
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column	Cytiva	28-9893-35
Image Gauge Software	FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
ImmunoStar LD	FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation	292-69903
KMX-1	Millipore	MAB3408	1:5,000 dilution
LAS-4000 luminescent image analyzer	FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
leupeptin	Peptide Institute Inc.	43449-62
MgSO4	Nacalai Tesque	21003-75
Na3VO4	Nacalai Tesque	32013-92
NaF	Nacalai Tesque	31420-82
okadaic acid	LC Laboratories	O-2220
OPTIMA MAX-XP	Beckman Coulter	393315
pepstatin	Nacalai Tesque	26436-52
PMSF	Nacalai Tesque	27327-81
Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2	Beckman Coulter	343778
Protease inhibitor cocktail (cOmplete, EDTA-free)		Roche	5056489001
Purified tubulin	Cytoskeleton	T240
QSONICA Q55	QSonica	Q55
Taxol		LC Laboratories	P-9600
TLA-120.2 rotor	Beckman Coulter	357656
TLA-55 rotor	Beckman Coulter	366725
TLCK	Nacalai Tesque	34219-94
Triton X-100	Nacalai Tesque	12967-45
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich	G9422