Técnica quantitativa de fracionamento de microtúbulos para separar microtúbulos estáveis, microtúbulos lábeis e tubulina livre em tecidos de camundongos

Summary

Os microtúbulos, que são polímeros da tubulina, desempenham um papel crucial como componente do citoesqueleto em células eucarióticas e são conhecidos por sua instabilidade dinâmica. Este estudo desenvolveu um método de fracionamento de microtúbulos para separá-los em microtúbulos estáveis, microtúbulos lábeis e tubulina livre para avaliar a estabilidade de microtúbulos em vários tecidos de camundongos.

Abstract

Microtúbulos, compostos por dímeros de α/β-tubulina, são um componente crucial do citoesqueleto em células eucarióticas. Esses polímeros semelhantes a tubos exibem instabilidade dinâmica à medida que subunidades heterodímeras de tubulina sofrem polimerização e despolimerização repetitivas. O controle preciso da estabilidade e dinâmica dos microtúbulos, obtido através de modificações pós-traducionais da tubulina e proteínas associadas aos microtúbulos, é essencial para várias funções celulares. Disfunções nos microtúbulos estão fortemente implicadas na patogênese, incluindo doenças neurodegenerativas. A pesquisa em andamento concentra-se em agentes terapêuticos direcionados a microtúbulos que modulam a estabilidade, oferecendo opções potenciais de tratamento para essas doenças e cânceres. Consequentemente, a compreensão do estado dinâmico dos microtúbulos é crucial para avaliar a progressão da doença e os efeitos terapêuticos.

Tradicionalmente, a dinâmica dos microtúbulos tem sido avaliada in vitro ou em células cultivadas através de fracionamento rugoso ou imunoensaio, usando anticorpos visando modificações pós-traducionais da tubulina. No entanto, a análise precisa do estado da tubulina em tecidos usando tais procedimentos impõe desafios. Neste estudo, desenvolvemos um método simples e inovador de fracionamento de microtúbulos para separar microtúbulos estáveis, microtúbulos lábeis e tubulina livre em tecidos de camundongos.

O procedimento envolveu a homogeneização de tecidos dissecados de camundongos em tampão estabilizador de microtúbulos na proporção de volume de 19:1. Os homogeneizados foram então fracionados através de um processo de ultracentrifugação em duas etapas após centrifugação lenta inicial (2.400 × g) para remoção de debris. A primeira etapa de ultracentrifugação (100.000 × g) precipitou microtúbulos estáveis, enquanto o sobrenadante resultante foi submetido a uma segunda etapa de ultracentrifugação (500.000 × g) para fracionar microtúbulos lábeis e dímeros de tubulina solúveis. Este método determinou as proporções de tubulina constituindo microtúbulos estáveis ou lábeis no cérebro de camundongos. Adicionalmente, variações teciduais distintas na estabilidade dos microtúbulos foram observadas que se correlacionaram com a capacidade proliferativa das células constituintes. Esses achados destacam o potencial significativo deste novo método para analisar a estabilidade de microtúbulos em condições fisiológicas e patológicas.

Introduction

Microtúbulos (MTs) são estruturas tubulares alongadas constituídas por protofilamentos constituídos por subunidades heterodímeras de α/β-tubulina. Desempenham papéis essenciais em vários processos celulares, como divisão celular, motilidade, manutenção da forma e transporte intracelular, tornando-se componentes integrantes do citoesqueleto eucariótico¹. A extremidade inferior das MTs, onde a subunidade α-tubulina é exposta, é relativamente estável, enquanto a extremidade superior, onde a subunidade β-tubulina é exposta, sofre despolimerização dinâmica e polimerização². Esse ciclo contínuo de adição e dissociação de dímeros de tubulina na extremidade superior, denominado instabilidade dinâmica, resulta em um processo repetitivo de resgate e catástrofe³. As MTs exibem domínios focais com variações localizadas na instabilidade dinâmica, incluindo domínios estáveis e lábeis⁴.

O controle preciso da instabilidade dinâmica das MTs é crucial para inúmeras funções celulares, particularmente em neurônios caracterizados por morfologias intrincadas. A adaptabilidade e a durabilidade das MTs desempenham um papel vital no desenvolvimento e funcionamento adequado das células nervosas ^5,6,7. A instabilidade dinâmica das MTs tem sido associada a várias modificações pós-traducionais (MPTs) da tubulina, tais como acetilação, fosforilação, palmitoilação, destirosinação, delta 2, oxidação de poliglutamina e poliglicilação. Além disso, a ligação de proteínas associadas a microtúbulos (MAPs) serve como mecanismo regulatório⁸. As MPTs, excluindo a acetilação, ocorrem predominantemente na região carboxi-terminal da tubulina, situada na superfície externa das MTs. Essas modificações criam diversas condições de superfície nas MTs, influenciando sua interação com as MAPs e, em última análise, governando a estabilidade das MTs⁹. A presença de um resíduo de tirosina carboxi-terminal na α-tubulina é indicativa de MTs dinâmicas, que são rapidamente substituídas pelo pool de tubulina livre. Por outro lado, a destirosinação do terminal carboxi e a acetilação de Lys40 significam MTs estáveis com reduzida instabilidade dinâmica ^9,10.

As MPTs da tubulina têm sido extensivamente empregadas em experimentos para avaliar a dinâmica e estabilidade de MTs ^{5,7,11,12,13,14,15}. Por exemplo, em estudos de cultura celular, as tubulinas podem ser segregadas em dois pools: o pool de tubulina livre e o pool de MT. Isso é conseguido liberando-se tubulina livre através da permeabilização celular antes da fixação das MTs remanescentes 15,16,17,18,19. Os métodos bioquímicos envolvem o uso de estabilizantes químicos de MT que protegem MTs de catástrofes, possibilitando a separação de MTs e tubulina livre através de centrifugação^20,21,22. No entanto, esses procedimentos não diferenciam entre MTs estáveis e menos estáveis (lábeis), tornando impossível quantificar MTs ou tubulina solúvel em tecidos como o cérebro. Consequentemente, avaliar a estabilidade da MT em organismos sob condições fisiológicas e patológicas tem se mostrado um desafio. Para resolver essa limitação experimental, desenvolvemos uma nova técnica para separar com precisão MTs e tubulina livre em tecido de^{camundongos23}.

Este método único de fracionamento de MT envolve homogeneização de tecidos sob condições que mantêm o status de tubulina nos tecidos e centrifugação em duas etapas para separar MTs estáveis, MTs lábeis e tubulina livre. Este procedimento simples pode ser aplicado a estudos amplos, incluindo pesquisa básica sobre MTs e MAPs em organismos vivos, análises fisiológicas e patológicas de saúde e doenças associadas à estabilidade de MT, e desenvolvimento de drogas e outras terapêuticas que visam MTs.

Protocol

1. Método de fracionamento MT NOTA: Todos os experimentos realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Doshisha. Camundongos C57BL/6J de ambos os sexos, com 3-4 meses de idade, foram usados aqui. Nesse protocolo, os tecidos dissecados, por exemplo, cérebro, fígado ou timo, foram imediatamente homogeneizados em tampão estabilizador de microtúbulos (MSB) gelado, que continha Taxol (estabilizador de MT) em uma concentração que impe…

Representative Results

Quantificação de tubulina nas frações P2, P3 e S3 do cérebro de camundongos pelo método de fracionamento de MTA tubulina em tecido de camundongo foi separada nas frações P2, P3 e S3 pelo método de fracionamento MT e quantificada por Western blotting (Figura 1A). O precipitado de MTs que permaneceram na fração P2 por ultracentrifugação a 100.000 × g por 20 min representou 34,86% ± 1,68% da tubulina total em cérebro de camundongo. O sobrenadante (S…

Discussion

A tarefa mais significativa ao investigar o estado da tubulina em tecidos de organismos vivos é prevenir a polimerização acidental de MT ou a despolimerização durante a preparação. A estabilidade das MTs nas amostras é afetada por fatores como a concentração de Taxol em MSB, a proporção da quantidade de tecido em tampão e a temperatura durante o processo, desde a remoção do tecido até a homogeneização e centrifugação. Portanto, as condições foram otimizadas em cada etapa do protocolo para análise d…

Materials

1.5 ML TUBE CASE OF 500	Beckman Coulter	357448
1A2	Sigma-Aldrich	T9028	1:5,000 dilution
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Nacalai Tesque	02442-44
300 kDa ultrafiltration spin column	Aproscience	PT-1013
6-11B1	Sigma-Aldrich	T7451	1:5,000 dilution
AKTA prime plus	Cytiva
anti-mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-035-146	1:5,000 dilution
antipain	Peptide Institute Inc.	4062
aprotinin	Nacalai Tesque	03346-84
Chemi-Lumi One L	Nacalai Tesque	07880-54
Corning bottle-top vacuum filter system	Corning	430758	0.22µm 33.2cm² Nitrocellulose membrane
DIFP	Sigma-Aldrich	55-91-4
DIGITAL HOMOGENIZER		AS ONE	HOM
DM1A	Sigma-Aldrich	T9026	1:5,000 dilution
DTT	Nacalai Tesque	14128-46
EGTA	Nacalai Tesque	37346-05
FluoroTrans W 3.3 Meter Roll	Pall Corporation	BSP0161
glycerol	Nacalai Tesque	17018-25
GTP		Nacalai Tesque	17450-61
HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman		TOMY
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column	Cytiva	28-9893-35
Image Gauge Software	FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
ImmunoStar LD	FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation	292-69903
KMX-1	Millipore	MAB3408	1:5,000 dilution
LAS-4000 luminescent image analyzer	FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
leupeptin	Peptide Institute Inc.	43449-62
MgSO4	Nacalai Tesque	21003-75
Na3VO4	Nacalai Tesque	32013-92
NaF	Nacalai Tesque	31420-82
okadaic acid	LC Laboratories	O-2220
OPTIMA MAX-XP	Beckman Coulter	393315
pepstatin	Nacalai Tesque	26436-52
PMSF	Nacalai Tesque	27327-81
Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2	Beckman Coulter	343778
Protease inhibitor cocktail (cOmplete, EDTA-free)		Roche	5056489001
Purified tubulin	Cytoskeleton	T240
QSONICA Q55	QSonica	Q55
Taxol		LC Laboratories	P-9600
TLA-120.2 rotor	Beckman Coulter	357656
TLA-55 rotor	Beckman Coulter	366725
TLCK	Nacalai Tesque	34219-94
Triton X-100	Nacalai Tesque	12967-45
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich	G9422