Studere membranproteinhandel i Drosophila Fotoreseptorceller ved hjelp av eGFP-taggede proteiner
Summary
Her er ikke-invasive metoder beskrevet for lokalisering av fotoreseptormembranproteiner og vurdering av retinal degenerasjon i Drosophila sammensatt øye ved hjelp av eGFP fluorescens.
Abstract
Membranproteinhandel regulerer inkorporering og fjerning av reseptorer og ionkanaler i plasmamembranen. Denne prosessen er fundamentalt viktig for cellefunksjon og celleintegritet av nevroner. Drosophila fotoreseptorceller har blitt en modell for å studere membranproteinhandel. Foruten rhodopsin, som ved belysning blir internalisert fra fotoreseptormembranen og er degradert, viser den forbigående reseptorpotensiallignende (TRPL) ionkanalen i Drosophila en lysavhengig translokasjon mellom rhabdomeral fotoreseptormembran (hvor den ligger i mørket) og fotoreseptorcellekroppen (som den transporteres til ved belysning). Denne intracellulære transporten av TRPL kan studeres på en enkel og ikke-invasiv måte ved å uttrykke eGFP-merket TRPL i fotoreseptorceller. EGFP-fluorescensen kan deretter observeres enten i den dype pseudopupilen eller ved vanninnlevelsesmikroskopi. Disse metodene tillater deteksjon av fluorescens i det intakte øyet og er derfor nyttige for høygjennomstrømningsanalyser og genetiske skjermer for Drosophila-mutanter som er defekte i TRPL-translokasjon. Her forklares forberedelsen av fluer, mikroskopiske teknikker, samt kvantifiseringsmetoder som brukes til å studere denne lysutløste translokasjonen av TRPL i detalj. Disse metodene kan også brukes til menneskehandelstudier på andre Drosophila fotoreseptorproteiner, for eksempel rhodopsin. I tillegg, ved å bruke eGFP-merkede rabdomerale proteiner, kan disse metodene brukes til å vurdere degenerasjon av fotoreseptorceller.
Introduction
Ved å levere og fjerne proteiner til og fra plasmamembranen kontrollerer membranproteinhandel i nevroner plasmamembranutstyret med reseptorer samt ionkanaler og regulerer derfor nevronfunksjonen. Feilregulering eller defekter i proteinhandel har vanligvis skadelige effekter på celler og resulterer i nevronal degenerasjon. Hos mennesker kan dette forårsake nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers og Parkinsons sykdom eller Retinitis pigmentosa1. Fotoreseptorer i det sammensatte øyet til Drosophila melanogaster har blitt et in vivo-modellsystem for å studere membranproteinhandel2. Dette skyldes ikke bare den genetiske allsidigheten til Drosophila som tillater effektive genetiske skjermer, men også fordi alle viktige komponenter i den lysabsorberende fotoreseptormembranen er preget i detalj og effektive mikroskopiske teknikker er tilgjengelige som kan brukes på flueøyet. Disse teknikkene er fokus i denne artikkelen.
I Drosophila fotoreseptorceller danner den apikale plasmamembranen en tettpakket stabel med mikrovilli langs den ene siden av cellen, kalt rhabdomere. Rhabdomeres av fotoreseptorceller R1-6 er ordnet i et karakteristisk trapesformet mønster mens fotoreseptorceller R7 og R8 danner en enkelt rhabdomere i midten av denne trapesformet3. Membranproteinhandel er nødvendig for en regulert omsetning av rhabdomerale membranproteiner som rhodopsin og den lysaktiverte TRP (forbigående reseptorpotensial) og TRPL (TRP-lignende) ionkanaler for å sikre riktig mengde av disse fototransduksjonsproteinene i rhabdomere. Fotoreseptormembranproteiner syntetiseres i det endoplasmatiske retikulumet og transporteres via Golgi-apparatet til rhabdomere. Etter aktivering av rhodopsin ved lys, kan et rhodopsinmolekyl enten inaktiveres ved absorpsjon av en annen foton eller kan fjernes fra rhabdomere ved klarrinmediert endokytose. Endocytosed rhodopsin blir enten degradert i lysosomet eller resirkuleres tilbake til rhabdomere 4,5. Ionkanalen TRPL er også internalisert etter aktivering av fototransduksjonskaskaden og gjennomgår en lysavhengig translokasjon mellom rhabdomere (hvor den ligger når fluer holdes i mørket) og et ER-beriket oppbevaringsrom i cellekroppen (som den transporteres innen flere timer etter belysning) 6,7,8,9,10 . I motsetning til endokytosed rhodopsin, blir bare små mengder TRPL degradert via den endolysosomale banen, og flertallet lagres intracellulært i stedet og resirkuleres tilbake til rhabdomere ved mørk tilpasning6. TRPL kan dermed brukes til å analysere lysutløst smugling av plasmamembranproteiner. Drosophila fotoreseptorceller brukes også til å studere nevronal degenerasjon. Photoreceptor celle degenerasjon bestemmes ofte ved å vurdere strukturen av rabdomerer, som oppløses som følge av degenerative prosesser5.
For å studere subcellulær lokalisering av TRPL og rhodopsin i fotoreseptorceller eller fotoreseptorcelledegenerering, er det brukt to fluorescensmikroskopimetoder som varierer med hensyn til analysehastighet og oppløsning her. En veldig rask, ikke-invasiv metode som kan brukes til genetiske skjermer, men med en begrenset romlig oppløsning er påvisning av fluorescens i det dype pseudopupilet (DPP). DPP er et optisk fenomen av leddyr sammensatte øyne hvis geometriske opprinnelse har blitt forklart i detalj av Franceschini og Kirschfeld i 197111. Kort sagt, på flere optiske plan under netthinnen overlegg-bilder av rhabdomeres fra tilstøtende ommatidia kan observeres. På et fokalplan gjennom midten av øyets krumning danner disse overliggende projeksjonene et bilde som ligner den trapesformede utformingen av rhabdomeres i et enkelt ommatidium bare størrelsesorden større. Dette fenomenet kan også observeres uavhengig av eksogent uttrykk for fluorescensproteiner (f.eks. TRPL::eGFP8), noe som likevel gjør DPP enklere å oppdage (figur 1A-A‘)12. En annen ikke-invasiv metode er vanninnlevelsesmikroskopi som er avhengig av avbildning av fluorescerende merkede proteiner etter optisk nøytralisering av øynenes dioptriske apparat med vann (figur 1B-C‘)12. Ved hjelp av vann nedsenkningsmetoden kan den relative mengden TRPL::eGFP i rhabdomeres eller cellekropp vurderes kvantitativt for individuelle fotoreseptorceller. Videre kan ikke-translokerende fluorescensmerkede proteiner brukes til å evaluere rabdomeral integritet og for å bestemme tidsforløpet for en potensiell degenerasjon på en kvantitativ måte, som beskrevet her.
Mens opptak av DPP er den desidert enkleste og raskeste av disse metodene å utføre, er den romlige oppløsningen av data de genererer begrenset. I tillegg er det mange grunner til at en DPP kan være fraværende, som ikke nødvendigvis er merkbar av DPP-bildebehandling selv. Siden DPP representerer en oppsummering av flere ommatidia, går informasjon om individuelle celler tapt. Dermed tjener lavoppløselig DPP-avbildning en viktig funksjon i screening av et stort antall fluer, men bør generelt følges av opptak med høyere oppløsning ved hjelp av vanninnlevelsesmikroskopi. Vann nedsenkningsmikrografer tillater tolkninger om individuelle celler, utviklingsfeil, øyemorfologi, proteinfeillokalisering eller retinal degenerasjon samt kvantifisering av disse effektene. Denne protokollen beskriver disse to teknikkene i detalj.
Figur 1: Oversikt over mikroskopivariasjoner for Drosophila-øyet presentert i denne protokollen. Skjematiske representasjoner og eksemplariske mikrografer av (A-A”) fluorescerende dyp pseudopupil (DPP) avbildning, (B-B”) dødelig vanninnlevelsesmikroskopi av fluorescerende rabdomerer, og (C-C”) ikke-dødelige vanndråpemikroskopi av fluorescerende rhabdomere. Skalastang (A”): 100 μm. Skalastolper (B”–C”): 10 μm. Tallet er endret fra referanse13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anvendelsen av fluorescensproteiner og enkelhet i screening ved DPP-avbildning og retinal vanninnlevelsesmikroskopi har vist seg å være vellykket av mange grupper12. Strategier som ligner på de som presenteres her har blitt brukt i flere genetiske skjermer for å oppdage defekter i rhodopsinuttrykksnivåer, homeostase, retinal organisasjon eller cellulær integritet ved hjelp av Rh1::eGFP 17,18,19,20,21.</su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke våre studentforskere gjennom årene. Spesielt Nina Meyer, Sibylle Mayer, Juliane Kaim og Laura Jaggy, hvis data har blitt brukt i denne protokollen som representative resultater. Forskningen til vår gruppe presentert her ble finansiert av tilskudd fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (Hu 839/2-4, Hu 839/7-1) til Armin Huber.
Materials
| 15 mL centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| CO2 anaesthesia fly pad | Flystuff | 59-172 | |
| Cold light lamp (KL 1500 LCD) | Zeiss | ||
| Fiji/ImageJ | NIH | ||
| Fluorescence microscope with UV lamp, camera, filter set and software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition) | Zeiss | ||
| Fluorescent tube (Lumilux T8, L 30W/840, 4000 K, G13) [1750 Lux, Ee470nm = 298 µW cm-2, Ee590nm = 215 µW cm-2] and [760 Lux, Ee470nm = 173 µW cm-2, Ee590nm = 147 µW cm-2] |
Osram | 4050300518039 | |
| Laboratory pipette (20-200 µL) | Eppendorf | ||
| Object slide | Roth | 0656.1 | |
| Petri dish (94 mm) | Greiner Bio-One | 633102 | |
| Pipette tips (200 µL) | Labsolute | 7695844 | |
| Plasticine (Blu-Tack) | Bostik | 30811745 | |
| Stereo microscope (SMZ445) | Nikon | ||
| Stereo microscope with UV lamp, camera, filer set and software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12) | Leica |
References
- Wang, X., Huang, T., Bu, G., Xu, H. Dysregulation of protein trafficking in neurodegeneration. Molecular Neurodegeneration. 9. 9, 31 (2014).
- Schopf, K., Huber, A. Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells. European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).
- Hardie, R. C. The photoreceptor array of the dipteran retina. Trends in Neurosciences. 9, 419-423 (1986).
- Wang, T., Montell, C. Phototransduction and retinal degeneration in Drosophila. Pflügers Archiv – European Journal of Physiology. 454 (5), 821-847 (2007).
- Xiong, B., Bellen, H. J. Rhodopsin homeostasis and retinal degeneration: lessons from the fly. Trends in Neurosciences. 36 (11), 652-660 (2013).
- Bähner, M., et al. Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current. Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).
- Cronin, M. A., Lieu, M. -. H., Tsunoda, S. Two stages of light-dependent TRPL-channel translocation in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 119, 2935-2944 (2006).
- Meyer, N., Joel-Almagor, T., Frechter, S., Minke, B., Huber, A. Subcellular translocation of the eGFP-tagged TRPL channel in Drosophila photoreceptors requires activation of the phototransduction cascade. Journal of Cell Science. 119, 2592-2603 (2006).
- Oberegelsbacher, C., Schneidler, C., Voolstra, O., Cerny, A., Huber, A. The Drosophila TRPL ion channel shares a Rab-dependent translocation pathway with rhodopsin. European Journal of Cell Biology. 90 (8), 620-630 (2011).
- Wagner, K., Smylla, T. K., Lampe, M., Krieg, J., Huber, A. Phospholipase D and retromer promote recycling of TRPL ion channel via the endoplasmic reticulum. Traffic. , (2021).
- Franceschini, N., Kirschfeld, K. Les phénoménes de pseudopupille dans l’oeil compose de Drosophila. Kybernetik. 9 (5), 159-182 (1971).
- Pichaud, F., Desplan, C. A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia. Development. 128 (6), 815-826 (2001).
- Smylla, T. K., Wagner, K., Huber, A. Application of fluorescent proteins for functional dissection of the Drosophila visual system. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), (2021).
- Meyer, N. Mechanisms of the light-dependent translocation of the ion channel TRPL in the photoreceptors of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer. nat. University of Karlsruhe (TH). , (2005).
- Meyer, N., Oberegelsbacher, C., Dürr, T. D., Schäfer, A., Huber, A. An eGFP-based genetic screen for defects in light-triggered subcelluar translocation of the Drosophila photoreceptor channel TRPL. Fly. 2 (1), 36-46 (2008).
- Zheng, L., Carthew, R. W. Lola regulates cell fate by antagonizing Notch induction in the Drosophila eye. Mechanisms of Development. 125 (1-2), 18-29 (2008).
- Hibbard, K. L., O’Tousa, J. E. A role for the cytoplasmic DEAD box helicase Dbp21E2 in rhodopsin maturation and photoreceptor viability. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 177-188 (2012).
- Huang, Y., Xie, J., Wang, T. A Fluorescence-based genetic screen to study retinal degeneration in Drosophila. PloS One. 10 (12), 0144925 (2015).
- Zhao, H., Wang, J., Wang, T. The V-ATPase V1 subunit A1 is required for rhodopsin anterograde trafficking in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1640-1651 (2018).
- Xiong, L., et al. ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice. Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).
- Zhao, H., Wang, T. PE homeostasis rebalanced through mitochondria-ER lipid exchange prevents retinal degeneration in Drosophila. PLoS Genetics. 16 (10), 1009070 (2020).
- Cerny, A. C., et al. The GTP- and phospholipid-binding protein TTD14 regulates trafficking of the TRPL ion channel in Drosophila photoreceptor cells. PLoS Genetics. 11 (10), 1005578 (2015).
- Richter, D. Structural and functional analyses of TRP ion channels in the photoreceptor cells of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer, nat. University of Karlsruhe (TH). , (2007).
- Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila. Biologie du développement. 351 (1), 128-134 (2011).
- Hardie, R. C., Liu, C. -. H., Randall, A. S., Sengupta, S. In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).
- Chakrabarti, P., et al. A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors. PLoS Genetics. 11 (1), 1004948 (2015).
