Быстрое пятно Гольджи для визуализации дендритного позвоночника в гиппокампе и префронтальной коре

Summary

Протокол описывает модификацию быстрого метода Гольджи, который может быть адаптирован к любой части нервной системы, для окрашивания нейронов в гиппокампе и медиальной префронтальной коре крысы.

Abstract

Пропитка Гольджи с использованием набора окрашивания Гольджи с незначительными адаптациями используется для пропитки дендритных шипов в гиппокампе крыс и медиальной префронтальной коре. Этот метод является заметным улучшением по сравнению с предыдущими методами пропитки Гольджи, потому что предварительно смешанные химические вещества безопаснее в использовании, нейроны последовательно хорошо пропитываются, существует гораздо меньше фонового мусора, а для данной области существуют чрезвычайно небольшие отклонения в плотности позвоночника между экспериментами. Более того, мозг может накапливаться после определенного момента и храниться замороженным до дальнейшей обработки. С помощью этого метода можно изучить любую область мозга, представляющую интерес. После окрашивания и проскальзывания покрытия плотность дендритного позвоночника определяется путем подсчета количества шипов на длину дендрита и выражается в виде плотности позвоночника на 10 мкм дендрита.

Introduction

Метод использования дихромата калия и нитрата серебра для маркировки нейронов был впервые описан Камилло Гольджи ^1,2 и впоследствии использован Сантьяго Рамоном-и-Кахалем для получения огромного объема работы, дифференцирующей нейронные и глиальные подтипы. Недавно опубликованная книга с его иллюстрациями теперь доступна³. После исследований Рамона-и-Кахала, которые были опубликованы более 100 лет назад, было использовано очень мало пропитки Гольджи. Пропитка Гольджи – это трудоемкий процесс, позволяющий осуществлять трехмерную визуализацию нейронов с помощью светового микроскопа. На протяжении многих лет было проведено множество модификаций метода Гольджи, чтобы сделать метод проще, а окрашивание более последовательным⁴. В 1984 году Габботт и Somogyi⁵ описали процедуру пропитки Гольджи с одним участком, которая позволила ускорить обработку. Этот метод пропитки Гольджи требует перфузии 4% параформальдегида и 1,5% пикриновой кислоты, постфиксации с последующим разделением вибратома в ванну с 3% дихромата калия. Секции крепятся на стеклянные горки, четыре угла обшивки приклеиваются так, чтобы при погружении в нитрат серебра диффузия происходила постепенно. Затем крышки отрываются, секции обезвоживаются, и в конечном итоге крышка постоянно скользит с монтажной средой. Этот метод был успешно использован для маркировки нейронов и глии ^6,7,8 в гиппокампе. Быстрый метод Гольджи, описанный здесь, является улучшением, потому что существует гораздо меньшее воздействие как дихромата калия, так и нитрата серебра, и не используются параформальдегид и пикриновая кислота. Кроме того, хотя клетки, которые были пропитаны с использованием модификаций метода Габботта и Сомогьи^{5, могли} быть проанализированы, часто участки подвергались чрезмерному или недостаточному воздействию или падали с слайдов на стадии обезвоживания, и, как правило, несколько экспериментов должны были быть объединены, чтобы иметь достаточное количество клеток для анализа.

Настоящий протокол описывает использование набора окрашивания Гольджи (см. Таблицу материалов) для маркировки дендритов и дендритных шипов в гиппокампе и медиальной префронтальной коре (mPFC) крысы. Преимущества этого метода перед предыдущими заключаются в том, что он быстрый, для исследователя меньше воздействия вредных химических веществ и происходит последовательное окрашивание нейронов. Протокол, описанный ниже, использовался с незначительными изменениями для оценки плотности дендритного позвоночника в гиппокампе и mPFC крысы во многих исследованиях 9,10,11,12,13,14,15.

Protocol

Все экспериментальные процедуры одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Святого Сердца и соответствуют Руководству NIH по уходу за животными и их использованию. 1. Выделение и инфильтрация мозговой ткани …

Representative Results

Используя быстрый метод Гольджи, клетки последовательно хорошо пропитываются, так что есть много клеток для анализа. Это заметное улучшение по сравнению с предыдущими методами, где эксперименты должны были быть объединены, чтобы иметь достаточно данных для анализа. Таким образом, боль…

Discussion

Настоящий протокол описывает метод пропитки Гольджи, позволяющий быстро одновременно обрабатывать многие срезы. Это улучшение по сравнению с ранее описанными⁵ более трудоемкими методами и последовательно дает пропитанные нейроны для анализа. Кроме того, существует мень?…

Materials

Cardboard slides trays	Fisher Scientific	12-587-10
Coverslips 24 x 60mm	Fisher Scientific	12-545-M
FD Rapid GolgiStain kit	FD Neurotechnologies	PK 401	Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit
Freezing Spray	Fisher Scientific	23-022524
HISTO-CLEAR	Fisher Scientific	50-899-90147	clearing agent
NCSS Software	Kaysville, UT, USA
Permount	Fisher Scientific	SP-15-100	mounting medium
Superfrost Plus Microscope slides	Fisher Scientific	12-550-15
Tissue Tek CTYO OCT Compound	Fisher Scientific	14-373-65	Used to mount brains on cryostat chuck