ウズラ絨毛尿膜 - 光線力学診断と治療のためのツール
Summary
鳥胚の絨毛尿膜(CAM)は、さまざまな研究分野に非常に有用で適用可能なツールです。ニホンウズラCAMの特別なexovoモデルは、光線力学処理の研究に適しています。
Abstract
鳥胚の絨毛尿膜(CAM)は、一次呼吸器として機能する薄い胚外膜です。その特性により、血管新生、腫瘍増殖、薬物送達システム、または光線力学診断(PDD)および光線力学療法(PDT)を研究するための優れた in vivo 実験モデルになります。同時に、このモデルは、実験動物を適切な代替品に置き換えるための要件に対処します。 Ex ovo 培養胚は、物質の適用、アクセス、モニタリング、および文書化を容易にします。最も頻繁に使用されるのはひよこCAMです。ただし、この記事では、低コストで高スループットのモデルとしての日本のウズラCAMの利点について説明します。もう一つの利点は、より短い胚発生であり、それはより高い実験的代謝回転を可能にする。ここでは、癌および微生物感染のPDDおよびPDTに対するウズラCAMの適合性を探ります。一例として、送達系としてのリポタンパク質またはナノ粒子と組み合わせた光増感剤ヒペリシンの使用が記載されている。白色光の画像からの損傷スコアと紫色光(405 nm)下でのCAM組織の蛍光強度の変化を、組織学的切片の分析とともに決定しました。ウズラCAMは、血管系および組織に対するPDTの効果を明確に示しました。さらに、毛細血管出血、血栓症、小血管の溶解、大血管の出血などの変化が観察されました。日本のウズラCAMは、光線力学診断や治療研究のための有望な in vivo モデルであり、腫瘍血管新生の研究、抗血管療法、抗菌療法に応用されています。
Introduction
鶏絨毛尿膜(CAM)モデルはよく知られており、さまざまな研究分野で広く使用されています。それはガス交換とミネラル輸送を提供する豊かな血管新生胚外器官です1。この膜の透明性とアクセス可能性により、個々の血管とその構造変化をリアルタイムで観察できます2。利点にもかかわらず、ひよこCAMには、他の鳥類種を使用することで回避できるいくつかの制限(たとえば、より大きな繁殖施設、産卵、飼料消費など)もあります。このプロトコルでは、ニホンウズラ(Coturnix japonica)胚を用いた代替のex ovo CAMモデルが記載されている。その小さいサイズのために、それはチキンCAMよりはるかに多くの実験的個体の使用を可能にする。さらに、ウズラの胚の16日間の胚発生が短いことは別の利点です。ウズラCAMの最初の大きな血管は、胚の日(ED)7に現れます。これは、ニワトリの胚発生(ステージ4〜35)と直接比較することができます。しかし、発生の後期段階はもはや比較できず、ウズラの胚3に必要な時間は短くなります。興味深いのは、チキンCAMと同様の微小血管分岐の定期的な発生です4,5,6。急速な性的成熟、高い卵産生、および低コストの繁殖は、この実験モデル7の使用を支持する他の例です。
鳥類CAMモデルは、光線力学療法(PDT)研究でよく使用されます8。PDTは、いくつかの形態の癌(小さな限局性腫瘍)およびその他の非腫瘍性疾患の治療に使用されます。その原理は、損傷した組織への蛍光薬、光増感剤(PS)の送達と、適切な波長の光によるその活性化にあります。研究に使用される有望なPSの1つは、もともと薬用植物セントジョンズワート(Hypericum perforatum)から分離されたヒペリシンです9。この化合物の強力な光増感効果は、その光化学的および光物理的特性に基づいています。これらは、約600nmで蛍光の発光を誘発する400〜600nmの範囲の複数の蛍光励起ピークによって特徴付けられる。スペクトルバンド内のヒペリシンの吸収極大は540〜590nmの範囲にあり、蛍光極大は590〜640nmの範囲にある9。これらの光増感効果を達成するために、ヒペリシンは局所投与後に波長405nmのレーザー光によって励起される10。光の存在下では、ヒペリシンは殺ウイルス性、抗増殖性、および細胞毒性の効果を示す可能性があります11が、全身毒性はなく、生物から急速に放出されます。ヒペリシンは、水不溶性の非蛍光凝集体を形成する親油性物質であるため、ポリマーナノ粒子12,13や高密度および低密度リポタンパク質(HDL、LDL)14,15などの数種類のナノキャリアを使用して、その送達と細胞への浸透を助けます。CAMは自然に免疫不全のシステムであるため、腫瘍細胞を膜表面に直接移植することができます。このモデルは、定義されたスコア16,17に従ってPDT誘発血管損傷の程度を記録するのにも適しています。PDTに比べて低強度の光は、光線力学診断(PDD)に使用することができる。紫色励起LED光の下で組織を監視することは、蛍光灯の放出をもたらす光増感剤18,19,20の光活性化にもつながりますが、PDT反応を開始して細胞に損傷を与えるのに十分なエネルギーを提供しません。腫瘍の視覚化と診断、または使用済みPSs 14,15の薬物動態のモニタリングに適したツールになります。
この記事では、生存率が80%を超えるウズラ のex ovo CAMアッセイの準備について説明します。この 卵外 培養は、多数の実験で首尾よく適用された。
Protocol
Representative Results
Discussion
卵外培養を成功させるには、上記のプロトコルに従うことが重要です。さらに、卵が十分に注意深く開かれていないか、栽培中に湿度が不十分な場合、卵黄袋は殻にくっついて破裂することがよくあります。卵の孵化の約60時間の時点での卵子培養の開始は、胚がすでに取り扱いを生き残るのに十分な大きさであるため、胚の高い生存率を保証します。発達後期には、CAMが薄く?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業はVEGA 2/0042/21とAPVV 20-0129によってサポートされました。V. Huntošováの貢献は、プロジェクトの実施の結果です:医学における現代の学際的研究のためのオープンサイエンスコミュニティ(頭字語:OPENMED)、ITMS2014 +:ERDFによって資金提供された運用プログラム統合インフラストラクチャによってサポートされている313011V455。
Materials
| 6-Well Cell Culture Plate | Sarstedt | 83.392 | Transparent polystyrene, sterile |
| CO2 Incubator ESCO CCL-0508 | ESCO, Singapore | CCL-050B-8 | CO2 cell culture incubator |
| cryocut Leica CM 1800 | Reichert-Jung, USA | ||
| digital camera Canon EOS 6D II | Canon, Japan | ||
| diode laser 405 nm | Ocean Optics, USA | ||
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | dimethyl sulfoxid |
| eosin | Sigma-Aldrich | 15086-94-9 | |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| fine brush size 2 | Faber-Castell | 281802 | brush for CAM separation and manipulation |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
| hematoxylin | Sigma-Aldrich | 517-28-2 | |
| hypericin | Sigma-Aldrich | 84082-80-4 | |
| incubator Bios Midi | Bios Sedl any, Czech Republic |
Forced draught incubator for initial incubation | |
| incubator Memmert IF160 | Memmert, Germany | Forced air circulation incubator for CAM incubation | |
| Kaiser slimlite plano, LED light box | Kaiser, Germany | 2453 | Transilluminator |
| LED light 405 nm | custom made circular LED light | ||
| macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8 | Canon, Japan | ||
| microscope Kapa 2000 | Kvant, Slovakia | optical microscope | |
| microtome Auxilab 508 | Auxilab, Spain | manual rotary microtome | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | |
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | parafin medium for tissue embedding |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Phosphate saline buffer |
| scissors Castroviejo | Orimed | OR66-108 | micro scissors for CAM separation |
| software ImageJ 1.53 | public domain | image processing and analysis program | |
| stock solution HDL | Sigma-Aldrich | 437641-10MG | high density lipoproteins |
| stock solution LDL | Sigma-Aldrich | 437644-10MG | low density lipoproteins |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles |
References
- Nowak-Sliwinska, P., van Beijnum, J. R., van Berkel, M., vanden Bergh, H., Griffioen, A. W. Vascular regrowth following photodynamic therapy in the chicken embryo chorioallantoic membrane. Angiogenesis. 13 (4), 281-292 (2010).
- van Leengoed, H. L. L. M., vander Veen, N., Versteeg, A. A. C., Ouellet, R., van Lier, J. E., Star, W. M. In-vivo photodynamic effects of phthalocyanines in a skin-fold observation chamber model: role of central metal ion and degree of sulfonation. Photochemistry Photobiology. 58 (4), 575-580 (1993).
- Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. R. Developmental stages of the Japanese quail. Journal of Anatomy. 216 (1), 3 (2010).
- De Fouw, D. O., Rizzo, V. J., Steinfeld, R., Feinberg, R. N. Mapping of the microcirculation in the chick chorioallantoic membrane during normal angiogenesis. Microvascular Research. 38 (2), 136-147 (1989).
- Sandau, K., Kurz, H. Modelling of vascular growth processes: a stochastic biophysical approach to embryonic angiogenesis. Journal of Microscopy. 175 (3), 205-213 (1994).
- Kurz, H., Ambrosy, S., Wilting, J., Marmé, D., Christ, B. Proliferation pattern of capillary endothelial cells in chorioallantoic membrane development indicates local growth control, which is counteracted by vascular endothelial growth factor application. Developmental Dynamics. 203 (2), 174-186 (1995).
- Huss, D., Poynter, G., Lansford, R. Japanese quail (Coturnix japonica) as laboratory animal model. Lab Animal. 37 (11), 513-519 (2008).
- Gottfried, V., Lindenbaum, E. S., Kimel, S. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as an in-vivo model for photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 12 (2), 204-207 (1992).
- Miškovský, P. Hypericin – a new antiviral and antitumor photosensitizer: mechanism of action and interaction with biological molecules. Current Drug Targets. 3 (1), 55-84 (2002).
- Čavarga, I., et al. Photodynamic effect of hypericin after topical application in the ex ovo quail chorioallantoic membrane model. Planta Medica. 80 (1), 56-62 (2014).
- Martinez-Poveda, B., Quesada, A. R., Medina, M. A. Hypericin in the dark inhibits key steps of angiogenesis in vitro. Europan Journal of Pharmacology. 516 (2), 97-103 (2005).
- Datta, S., et al. Unravelling the excellent chemical stability and bioavailability of solvent responsive curcumin-loaded 2-ethyl-2-oxazoline-grad-2-(4-dodecyloxyphenyl)- 2-oxazoline copolymer nanoparticles for drug delivery. Biomacromolecules. 19 (7), 2459-2471 (2018).
- Huntošová, V., et al. Alkyl Chain length in poly(2-oxazoline)-based amphiphilic gradient copolymers regulates the delivery of hydrophobic molecules: a case of the biodistribution and the photodynamic activity of the photosensitizer hypericin. Biomacromolecules. 22 (10), 4199-4216 (2021).
- Buríková, M., et al. Hypericin fluorescence kinetics in the presence of low density lipoproteins: study on quail CAM assay for topical delivery. General Physiology and Biophysic. 35 (4), 459-468 (2016).
- Lenkavska, L., et al. Benefits of hypericin transport and delivery by low- and high-density lipoproteins to cancer cells: From in vitro to ex ovo. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 25, 214-224 (2019).
- Rück, A., Böhmler, A., Steiner, R. PDT with TOOKAD studied in the chorioallantoic membrane of fertilized eggs. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 2 (1), 79-90 (2005).
- Gottfried, V., Davidi, R., Averbuj, C., Kimel, S. In vivo damage to chorioallantoic membrane blood vessels by porphycene-induced photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 30 (2-3), 115-121 (1995).
- Buzzá, H. H., Silva, L. V., Moriyama, L. T., Bagnato, V. S., Kurachi, C. Evaluation of vascular effect of Photodynamic Therapy in chorioallantoic membrane using different photosensitizers. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 138, 1-7 (2014).
- Dougherty, T. J., et al. Photodynamic therapy. Journal of the National Cancer Institute. 90, 889-905 (1998).
- Xiang, L., et al. Real-time optoacoustic monitoring of vascular damage during photodynamic therapy treatment of tumor. Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 01400-01408 (2007).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), 2720 (2011).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
- Máčajová, M., Čavarga, I., Sýkorová, M., Valachovič, M., Novotná, V., Bilčík, B. Modulation of angiogenesis by topical application of leptin and high and low molecular heparin using the Japanese quail chorioallantoic membrane model. Saudi Journal of Biological Sciences. 27 (6), 1488-1493 (2020).
- Mangir, N., Dikici, S., Claeyssens, F., MacNeil, S. Using Ex Ovo chick chorioallantoic membrane (CAM) assay to evaluate the biocompatibility and angiogenic response to biomaterials. ACS Biomaterials Science Engineering. 5 (7), 3190-3200 (2019).
- Marshall, K. M., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C. Evolving applications of the egg: chorioallantoic membrane assay and ex vivo organotypic culture of materials for bone tissue engineering. Journal of Tissue Engineering. 11, 1-25 (2020).
- Merlos Rodrigo, M. A., et al. Extending the applicability of in ovo and ex ovo chicken chorioallantoic membrane assays to study cytostatic activity in neuroblastoma cells. Frontiers in Oncology. 11, 1-10 (2021).
- Meta, M., Kundeková, B., Bilčík, B., Máčajová, M. The effect of silicone ring application on CAM vasculature in Japanese Quail (Coturnix japonica). Proceedings of the Student Scientific Conference Faculty of Natural Sciences of Comenius University, Bratislava, Slovakia. , 385-390 (2019).
- Kohli, N., et al. Pre-screening the intrinsic angiogenic capacity of biomaterials in an optimised ex ovo chorioallantoic membrane model. Journal of Tissue Engineering. 11, 1-15 (2020).
- Kundeková, B., Máčajová, M., Meta, M., Čavarga, I., Bilčík, B. Chorioallantoic membrane models of various avian species differences and applications. Biology-Basel. 10 (4), 301 (2021).
- Parsons-Wingerter, P., Elliott, K. E., Clark, J. I., Farr, A. G. Fibroblast growth factor-2 selectively stimulates angiogenesis of small vessels in arterial tree. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 20 (5), 1250-1256 (2000).
- Buzzá, H. H., Zangirolami, A. C., Davis, A., Gómez-García, P. B., Kurachi, C. Fluorescence analysis of a tumor model in the chorioallantoic membrane used for the evaluation of different photosensitizers for photodynamic therapy. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 19, 78-83 (2017).
