下垂体幹細胞生物学を探るための In Vitro モデルとしてのマウス下垂体からのオルガノイドの開発
Summary
下垂体は、体の内分泌系の主要な調節因子である。この記事では、生物学的および機能がほとんど理解されていない腺の幹細胞集団を研究するための新しい3D in vitro モデルとして、マウス下垂体からのオルガノイドの開発を説明する。
Abstract
下垂体は、身体の成長、代謝、性的成熟、生殖、ストレス反応などの重要な生理学的プロセスを調節するマスター内分泌腺です。10年以上前、幹細胞は下垂体で同定されました。しかしながら、トランスジェニック in vivo アプローチの適用にもかかわらず、それらの表現型、生物学、および役割は不明のままである。この謎に取り組むために、下垂体幹細胞生物学を深く解明するために、新しく革新的なオルガノイド in vitro モデルが開発されています。オルガノイドは、定義された培養条件下で、組織の(上皮)幹細胞から自己発達し、それらの幹細胞およびその組織の複数の特徴を再現する3D細胞構造を表す。ここでは、マウスの下垂体由来オルガノイドが腺の幹細胞から発達し、 そのin vivo 表現型および機能的特徴を忠実に再現することが示されている。とりわけ、それらは、遺伝子導入的に加えられた局所的損傷に応答して生じる in vivo としての幹細胞の活性化状態を再現する。オルガノイドは、ステムネス表現型を堅牢に保持しながら、長期的に拡張可能である。この新しい研究モデルは、新生児の成熟から加齢に伴う退色、および健康な腺から罹患した腺に至るまで、下垂体リモデリングの重要な条件における幹細胞の表現型および挙動を解読するために非常に貴重である。ここでは、マウス下垂体由来オルガノイドを確立するための詳細なプロトコルが提示され、これは下垂体幹細胞のまだ謎めいた世界に飛び込むための強力なツールを提供する。
Introduction
下垂体は、脳の基部に位置する小さな内分泌腺であり、視床下部に接続されている。腺は、末梢および中枢(視床下部)入力を統合して、調整された調整されたホルモン放出を生成し、それによって下流の標的内分泌器官(副腎および生殖腺など)を調節して、適切なタイミングで適切なホルモンを産生する。下垂体は内分泌系の主要な調節因子であり、したがって正当にマスター腺1と呼ばれる。
マウスの下垂体は、3つの葉(図1)、すなわち、前葉(AL)、中間葉(IL)、および後葉(PL)からなる。主要な内分泌ALは、5つのホルモン細胞型を含みます, 成長ホルモンを産生するソマトトロープを含みます (GH);プロラクチン(PRL)を生成するラクトトロープ;副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)を分泌するコルチコトロペ;甲状腺刺激ホルモン(TSH)産生に関与する甲状腺綱;黄体形成ホルモン(LH)と卵胞刺激ホルモン(FSH)を作る性腺刺激薬。PLは、ホルモンオキシトシンおよびバソプレシン(抗利尿ホルモン)が貯蔵されている視床下部からの軸索突起からなる。ILはALとPLの間に位置し、メラノサイト刺激ホルモン(MSH)を産生するメラノトロープを収容する。ヒト下垂体では、ILは発生中に退行し、メラノトロープはAL1内に広がる。内分泌細胞に加えて、下垂体はまた、転写因子SOX2 2,3,4,5,6によって本質的にマークされる幹細胞のプールを含む。これらのSOX2+細胞は、辺縁帯(MZ)に位置し、裂け目の上皮内層(ALとILとの間の胚性残骸内腔)、またはALの実質全体にクラスターとして広がっている、それによって腺内の2つの幹細胞ニッチ(図1)2、3、4、5、6を提案する。
下垂体の不可欠な性質を考えると、腺の機能不全は重篤な罹患率と関連している。下垂体亢進症(1つ以上のホルモンの過剰分泌を特徴とする)および下垂体機能低下症(1つ以上のホルモンの産生の欠損または欠損)は、下垂体神経内分泌腫瘍(PitNET;例えば、クッシング病につながるACTH産生腫瘍)または遺伝的欠陥(例えば、小人症をもたらすGH欠乏症)によって引き起こされ得る7。さらに、下垂体手術(例えば、腫瘍を除去するため)、感染症(例えば、視床下部 – 下垂体結核、または細菌性髄膜炎または脳炎に続く感染症)、シーハン症候群(出産時の大量の失血による血流不足による壊死)、下垂体脳卒中および外傷性脳損傷は、下垂体機能低下の他の重要な原因である8.マウス下垂体が再生能力を有していることが示されており、内分泌細胞のトランスジェニックアブレーションによって導入された局所損傷を修復できることが示されている9、10。SOX2+幹細胞は、活性化された表現型を示す傷害に鋭く反応し、増殖の亢進(幹細胞の増殖をもたらす)および幹関連因子および経路(例えば、WNT/NOTCH)の発現増加によって特徴付けられる。さらに、幹細胞はアブレーションされたホルモンを発現し始め、最終的に9、10以下の(5〜6)ヶ月にわたって枯渇した細胞集団の実質的な回復をもたらす。また、腺の新生児成熟期(生後最初の3週間)には、下垂体幹細胞は活性化状態で繁栄しています6,11,12,13が、生物の老化は、加齢(または「炎症」)時の炎症性(マイクロ)環境の増加により、その場で幹細胞の機能が低下することと関連しています10,14.さらに、腺における腫瘍形成は、幹細胞活性化にも関連している7、15。幹細胞の活性化は、下垂体リモデリングのいくつかの状況(7,16でレビュー)で検出されているが、根底にあるメカニズムは不明のままである。in vivoアプローチ(トランスジェニックマウスにおける系統追跡など)は下垂体幹細胞の明確または包括的な画像を提供していないため、正常および罹患下垂体における幹細胞生物学を探索するための信頼性の高いin vitroモデルの開発が不可欠である。初代下垂体幹細胞の標準的な体外培養は、非常に限られた増殖能力および表現型の急速な喪失を伴う非生理学的(2D)状態のために不十分のままである(より詳細な概要については、16を参照されたい)。3Dスフェア培養物(pituispheres)は、サイド集団およびSOX2+表現型2,3,4によって同定された下垂体幹細胞から樹立されている。ピツイスフェアは幹細胞からクローン的に成長し、ステムネスマーカーを発現し、内分泌細胞型への分化能を示す。しかし、それらは限られた通過性(2〜3通路)しか示さず、かなり拡大しない3,4。スフェア様構造体は、50%希釈マトリゲル中で1週間培養した場合、非解離下垂体幹細胞クラスターからも得られたが、拡張性は示されなかった17。ピトイスフェアアプローチは、主に幹細胞数の読み出しツールとして使用されますが、さらなる用途は、劣った膨張容量16によって制限されています。
これらの欠点に対処し、克服するために、MZおよび実質幹細胞を含むマウスの主要な内分泌ALから始まる新しい3Dモデル、すなわちオルガノイドが最近確立されている。オルガノイドが実際に下垂体の幹細胞に由来し、その表現型を忠実に再現していることが示されている18。さらに、オルガノイドは長期的に拡張可能であり、その茎の性質を堅牢に維持する。したがって、それらは、深遠な探査のために初代下垂体幹細胞を拡大するための信頼できる方法を提供する。このような探査は、下垂体から単離することができる限られた数の幹細胞では達成不可能であり、これもまた、2D条件16において拡張可能ではない。オルガノイドは、新しい下垂体幹細胞の特徴(in vivoに翻訳可能)を明らかにするための貴重で信頼性の高いツールであることが示されています14,18。重要なことに、オルガノイドモデルは、局所組織損傷および新生児成熟の間に起こる下垂体幹細胞活性化状態を忠実に反映し、増強された形成効率を示し、上方制御された分子経路を複製する14、18。したがって、下垂体由来オルガノイドモデルは、革新的で強力な下垂体幹細胞生物学研究モデルであり、幹細胞活性化読み出しツールでもあります。
このプロトコールは、マウス下垂体由来オルガノイドの樹立を詳細に記載する。この目的のために、ALは単離され、単一細胞に解離し、それらは細胞外マトリックス模倣マトリゲル(本明細書ではECMと呼ぶ)に埋め込まれる。次いで、細胞-ECMアセンブリーを、幹細胞増殖因子および下垂体胚調節因子を本質的に含む定義済みの培地(さらに「下垂体オルガノイド培地」(PitOM)18; 表1)。オルガノイドが完全に発達すると(10〜14日後)、それらはさらにトラフシーケンシャル継代に拡張され、広範な下流探査(例えば、免疫蛍光、RT-qPCR、およびバルクまたは単一細胞トランスクリプトミクス; 図1)。長期的には、下垂体幹細胞オルガノイドが組織修復アプローチや再生医療への道を開くことが期待されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
AL由来オルガノイドは、ここに記載されるように、下垂体幹細胞をインビトロで研究するための強力な研究モデルを表す。現在、このオルガノイドアプローチは、初代下垂体幹細胞を確実かつ堅牢に増殖および増殖させるための唯一の利用可能なツールである。胚性幹細胞(ESC)または人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する下垂体オルガノイドモデルが以前に報告されており、これは下垂体胚…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ルーヴェン工科大学とフランダース科学研究基金(FWO)からの助成金によって支援されました。E.L. (11A3320N) および C.N. (1S14218N) は、FWO/FWO-SB の博士号フェローシップによってサポートされています。
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 48-well plates, TC treated, individually wrapped | Costar | 734-1607 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491023 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Base moulds | VWR | 720-1918 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Cassettes, Q Path Microtwin | VWR | 720-2191 | |
| Cell strainer, 40 µm mesh, disposable | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| D-glucose | Merck | 108342 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM, powder, high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Epredia HistoStar Embedding Workstation, 220 to 240Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol Absolute 99.8+% | Thermo Fisher Scientific | 10342652 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630056 | |
| InSolution Y-27632 | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-Free | Corning | 15505739 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Paraformaldehyde for synthesis (PFA) | Merck | 818715 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Phenol red | Merck | 107241 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Recombinant Human EGF Protein, CF | R&D systems | 236-EG | |
| Recombinant Human FGF basic/FGF2/bFGF (157 aa) Protein | R&D systems | 234-FSE | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Human IGF-1 | Peprotech | 100-11 | |
| Recombinant Human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| Recombinant Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Recombinant Human R-Spondin-1 | Peprotech | 120-38 | |
| Recombinant Human/Murine FGF-8b | Peprotech | 100-25 | |
| Recombinant Mouse Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-Terminus | R&D systems | 464-SH | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium di-Hydrogen Phosphate 1-hydrate | PanReac-AppliChem | A1047 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-Pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile water | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Syringe, with BD Microlance needle with intradermal bevel, 26G | BD Plastipak | BDAM303176 | |
| Thermo Scientific Excelsior ES Tissue Processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Titriplex III | Merck | 108418 | |
| TrypL Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| Trypsin solution 2.5 % | Thermo Fisher Scientific | 15090046 |
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