Hipofiz Kök Hücre Biyolojisini Keşfetmek için Fare Hipofizinden In Vitro Model Olarak Organoidlerin Geliştirilmesi
Summary
Hipofiz bezi, vücudun endokrin sisteminin anahtar düzenleyicisidir. Bu makalede, fare hipofizinden organoidlerin gelişimi, biyolojisi ve işlevi tam olarak anlaşılamayan bezin kök hücre popülasyonunu incelemek için yeni bir 3D in vitro model olarak açıklanmaktadır.
Abstract
Hipofiz, vücut büyümesi, metabolizma, cinsel olgunlaşma, üreme ve stres tepkisi dahil olmak üzere temel fizyolojik süreçleri düzenleyen ana endokrin bezidir. On yıldan fazla bir süre önce, hipofiz bezinde kök hücreler tanımlandı. Bununla birlikte, transgenik in vivo yaklaşımların uygulanmasına rağmen, fenotipleri, biyolojileri ve rolleri belirsizliğini korumaktadır. Bu gizemin üstesinden gelmek için, hipofiz kök hücre biyolojisini derinlemesine çözmek için yeni ve yenilikçi bir organoid in vitro model geliştirilmiştir. Organoidler, tanımlanmış kültür koşulları altında, bir dokunun (epitelyal) kök hücrelerinden kendi kendini geliştiren ve bu kök hücrelerin ve dokularının çoklu özelliklerini özetleyen 3D hücre yapılarını temsil eder. Burada, fare hipofiz kaynaklı organoidlerin bezin kök hücrelerinden geliştiği ve in vivo fenotipik ve fonksiyonel özelliklerini sadık bir şekilde özetlediği gösterilmiştir. Diğerlerinin yanı sıra, kök hücrelerin aktivasyon durumunu, transjenik olarak verilen lokal hasara yanıt olarak meydana gelen in vivo olarak yeniden üretirler. Organoidler uzun süreli genişletilebilirken, sap fenotiplerini sağlam bir şekilde korurlar. Yeni araştırma modeli, yenidoğan olgunlaşmasından yaşlanmaya bağlı solmaya ve sağlıklıdan hastalıklı bezlere kadar değişen hipofiz yeniden yapılanmasının temel koşulları sırasında kök hücrelerin fenotipini ve davranışını deşifre etmek için oldukça değerlidir. Burada, hipofiz kök hücrelerinin henüz esrarengiz dünyasına dalmak için güçlü bir araç sağlayan fare hipofiz türevi organoidleri oluşturmak için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.
Introduction
Hipofiz, hipotalamusa bağlı olduğu beynin tabanında bulunan küçük bir endokrin bezidir. Bez, ayarlanmış ve koordine edilmiş bir hormon salınımı oluşturmak için periferik ve merkezi (hipotalamik) girdileri bütünleştirir, böylece uygun zamanda uygun hormonları üretmek için aşağı akış hedef endokrin organlarını (adrenal bezler ve gonadlar gibi) düzenler. Hipofiz, endokrin sistemin anahtar düzenleyicisidir ve bu nedenle haklı olarak ana bez1 olarak adlandırılır.
Fare hipofizi üç lobdan oluşur (Şekil 1), yani ön lob (AL), ara lob (IL) ve arka lob (PL). Majör endokrin AL, büyüme hormonu (GH) üreten somatotroplar da dahil olmak üzere beş hormonal hücre tipi içerir; prolaktin (PRL) üreten laktotroplar; adrenokortikotropik hormon (ACTH) salgılayan kortikotroplar; tiroid stimüle edici hormon (TSH) üretiminden sorumlu tirotroplar; ve luteinize edici hormon (LH) ve folikül uyarıcı hormon (FSH) yapan gonadotroplar. PL, oksitosin ve vazopressin (antidiüretik hormon) hormonlarının depolandığı hipotalamustan aksonal projeksiyonlardan oluşur. IL, AL ve PL arasında bulunur ve melanosit uyarıcı hormon (MSH) üreten melanotropları barındırır. İnsan hipofizinde, IL gelişim sırasında geriler ve melanotroplar AL1 içinde yayılır. Endokrin hücrelere ek olarak, hipofiz bezi ayrıca esas olarak transkripsiyon faktörü SOX2 2,3,4,5,6 ile işaretlenmiş bir kök hücre havuzu içerir. Bu SOX2 + hücreleri, marjinal bölgede (MZ), yarığın epitel astarında (AL ve IL arasında embriyonik bir kalıntı lümen) bulunur veya AL’nin parankimi boyunca kümeler halinde yayılır, böylece bezde iki kök hücre nişi önerir (Şekil 1)2,3,4,5,6.
Hipofizin vazgeçilmez doğası göz önüne alındığında, bezin arızalanması ciddi morbidite ile ilişkilidir. Hiperpituitarizm (bir veya daha fazla hormonun aşırı salgılanması ile karakterizedir) ve hipopituitarizm (bir veya daha fazla hormonun kusurlu veya eksik üretimi) hipofiz nöroendokrin tümörlerinden (PitNET’ler; örneğin, Cushing hastalığına yol açan ACTH üreten tümörler) veya genetik kusurlardan (örneğin, cücelikle sonuçlanan BH eksikliği) kaynaklanabilir7. Ek olarak, hipofiz cerrahisi (örneğin, tümörleri çıkarmak için), enfeksiyonlar (örneğin, hipotalamik-hipofiz tüberkülozu veya bakteriyel menenjit veya ensefalit sonrası enfeksiyonlar), Sheehan sendromu (doğumda ağır kan kaybına bağlı yetersiz kan akışı nedeniyle nekroz), hipofiz apopleksi ve travmatik beyin hasarı, hipofiz hipofonksiyonunun diğer önemli nedenleridir8 . Fare hipofizinin rejeneratif kapasiteye sahip olduğu, endokrin hücrelerin transgenik ablasyonu ile ortaya çıkan lokal hasarı onarabildiği gösterilmiştir 9,10. SOX2 + kök hücreleri, artmış proliferasyon (kök hücre genişlemesi ile sonuçlanan) ve köklükle ilgili faktörlerin ve yolakların (örneğin, WNT / NOTCH) artan ekspresyonu ile işaretlenmiş aktif bir fenotip gösteren hasara akut tepki verir. Dahası, kök hücreler ablatlanmış hormonu eksprese etmeye başlar ve sonunda tükenmiş hücre popülasyonunun 9,10 ay boyunca (5 ila 6) önemli ölçüde restorasyonu ile sonuçlanır. Ayrıca, bezin yenidoğan olgunlaşma aşamasında (doğumdan sonraki ilk 3 hafta), hipofiz kök hücreleri aktif bir durumda gelişir 6,11,12,13, oysa organizma yaşlanması, yaşlanmada (veya ‘yanflamasyon’) artan enflamatuar (mikro-) ortam nedeniyle in situ kök hücre işlevselliğinin azalmasıyla ilişkilidir10,14 . Ek olarak, bezdeki tümörigenez de kök hücre aktivasyonu ile ilişkilidir 7,15. Kök hücre aktivasyonu çeşitli hipofiz yeniden şekillenme durumlarında tespit edilmiş olmasına rağmen (7,16’da gözden geçirilmiştir), altta yatan mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır. İn vivo yaklaşımlar (transgenik farelerde soy izleme gibi) hipofiz kök hücrelerinin net veya kapsamlı bir resmini sunmadığından, normal ve hastalıklı hipofizde kök hücre biyolojisini keşfetmek için güvenilir in vitro modellerin geliştirilmesi esastır. Primer hipofiz kök hücrelerinin standart in vitro kültürü, çok sınırlı büyüme kapasitesi ve hızlı fenotip kaybı olan fizyolojik olmayan (2D) koşullar nedeniyle yetersiz kalmaktadır (daha ayrıntılı bir genel bakış için bkz.16). 3D küre kültürleri (pituisferler), yan popülasyon ve SOX2 + fenotip 2,3,4 ile tanımlanan hipofiz kök hücrelerinden kurulmuştur. Pitusferler klonal olarak kök hücrelerden büyür, saplılık belirteçlerini eksprese eder ve endokrin hücre tiplerine farklılaşma kapasitesi gösterir. Bununla birlikte, sadece sınırlı geçitlilik (2-3 pasaj) gösterirken önemli ölçüde genişlemezler3,4. Küre benzeri yapılar, 1 hafta boyunca% 50 seyreltilmiş Matrigel’de kültürlendiğinde ayrışmamış hipofiz kök hücre kümelerinden de elde edildi, ancak genişletilebilirlik gösterilmedi17. Pituisfer yaklaşımı çoğunlukla kök hücre sayıları için bir okuma aracı olarak kullanılır, ancak daha sonraki uygulamalar daha düşük genişleme kapasitesi16 ile sınırlıdır.
Bu eksiklikleri ele almak ve üstesinden gelmek için, yakın zamanda MZ ve parankimal kök hücreleri içeren farelerin majör endokrin AL’sinden başlayarak organoidler olmak üzere yeni bir 3D model kurulmuştur. Organoidlerin gerçekten de hipofizin kök hücrelerinden türetildiği ve fenotipleri18’i sadık bir şekilde özetlediği gösterilmiştir. Dahası, organoidler uzun süreli genişletilebilirken, saplılık doğalarını sağlam bir şekilde korurlar. Bu nedenle, derin keşif için birincil hipofiz kök hücrelerini genişletmek için güvenilir bir yöntem sağlarlar. Bu tür bir araştırma, bir hipofizden izole edilebilen sınırlı sayıda kök hücre ile elde edilemez, bunlar da 2D koşullarda genişletilemez16. Organoidlerin yeni hipofiz kök hücre özelliklerini ortaya çıkarmak için değerli ve güvenilir araçlar olduğu gösterilmiştir (in vivo’ya çevrilebilir)14,18. Önemli olarak, organoid model, lokal doku hasarı ve yenidoğan olgunlaşması sırasında meydana gelen hipofiz kök hücre aktivasyon durumunu sadık bir şekilde yansıtmakta, gelişmiş oluşum etkinliği göstermekte ve yukarı regüle moleküler yolları kopyalamaktadır14,18. Bu nedenle, hipofiz kaynaklı organoid modeli, yenilikçi ve güçlü bir hipofiz kök hücre biyolojisi araştırma modelinin yanı sıra bir kök hücre aktivasyon okuma aracıdır.
Bu protokol, fare hipofiz türevi organoidlerin oluşumunu ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Bu amaçla, AL izole edilir ve hücre dışı matrisi taklit eden Matrigel’e (bundan böyle ECM olarak anılacaktır) gömülü olan tek hücrelere ayrışır. Hücre-ECM grubu daha sonra, esas olarak kök hücre büyüme faktörleri ve hipofiz embriyonik düzenleyicileri içeren tanımlanmış bir ortamda kültürlenir (ayrıca ‘hipofiz organoid ortamı’ (PitOM) 18; Tablo 1). Organoidler tamamen geliştikten sonra (10-14 gün sonra), sıralı pasajda daha da genişletilebilir ve kapsamlı aşağı akış araştırmasına tabi tutulabilirler (örneğin, immünofloresan, RT-qPCR ve toplu veya tek hücreli transkriptomikler; Şekil 1). Uzun vadede, hipofiz kök hücre organoidlerinin doku onarımı yaklaşımlarına ve rejeneratif tıbba giden yolu açması beklenmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
AL türevi organoidler, burada açıklandığı gibi, in vitro hipofiz kök hücrelerini incelemek için güçlü bir araştırma modelini temsil eder. Şu anda, bu organoid yaklaşım, birincil hipofiz kök hücrelerini güvenilir ve sağlam bir şekilde büyütmek ve genişletmek için mevcut tek araçtır. Embriyonik kök hücrelerden (ESC) veya indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC) türetilen ve hipofiz embriyonik organogenezi23’ü yakından özetleyen bir hipofiz organo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, KU Leuven Araştırma Fonu ve Bilimsel Araştırma Fonu (FWO) – Flanders’ın hibeleriyle desteklendi. E.L. (11A3320N) ve C.N. (1S14218N), FWO/FWO-SB’den doktora bursu ile desteklenmektedir.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 48-well plates, TC treated, individually wrapped | Costar | 734-1607 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491023 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Base moulds | VWR | 720-1918 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Cassettes, Q Path Microtwin | VWR | 720-2191 | |
| Cell strainer, 40 µm mesh, disposable | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| D-glucose | Merck | 108342 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM, powder, high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Epredia HistoStar Embedding Workstation, 220 to 240Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol Absolute 99.8+% | Thermo Fisher Scientific | 10342652 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630056 | |
| InSolution Y-27632 | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-Free | Corning | 15505739 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Paraformaldehyde for synthesis (PFA) | Merck | 818715 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Phenol red | Merck | 107241 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Recombinant Human EGF Protein, CF | R&D systems | 236-EG | |
| Recombinant Human FGF basic/FGF2/bFGF (157 aa) Protein | R&D systems | 234-FSE | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Human IGF-1 | Peprotech | 100-11 | |
| Recombinant Human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| Recombinant Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Recombinant Human R-Spondin-1 | Peprotech | 120-38 | |
| Recombinant Human/Murine FGF-8b | Peprotech | 100-25 | |
| Recombinant Mouse Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-Terminus | R&D systems | 464-SH | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium di-Hydrogen Phosphate 1-hydrate | PanReac-AppliChem | A1047 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-Pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile water | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Syringe, with BD Microlance needle with intradermal bevel, 26G | BD Plastipak | BDAM303176 | |
| Thermo Scientific Excelsior ES Tissue Processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Titriplex III | Merck | 108418 | |
| TrypL Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| Trypsin solution 2.5 % | Thermo Fisher Scientific | 15090046 |
References
- Melmed, S. . The pituitary. 3rd ed. , 1 (2011).
- Chen, J., et al. The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early-embryonic characteristics. Endocrinology. 146 (9), 3985-3998 (2005).
- Chen, J., et al. Pituitary progenitor cells tracked down by side population dissection. Stem Cells. 27 (5), 1182-1195 (2009).
- Fauquier, T., Rizzoti, K., Dattani, M., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C. A. F. SOX2-expressing progenitor cells generate all of the major cell types in the adult mouse pituitary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2907-2912 (2008).
- Rizzoti, K., Akiyama, H., Lovell-Badge, R. Mobilized adult pituitary stem cells contribute to endocrine regeneration in response to physiological demand. Cell Stem Cell. 13 (4), 419-432 (2013).
- Andoniadou, C. L., et al. Sox2+ stem/progenitor cells in the adult mouse pituitary support organ homeostasis and have tumor-inducing potential. Cell Stem Cell. 13 (4), 433-445 (2013).
- Nys, C., Vankelecom, H. Pituitary disease and recovery: How are stem cells involved. Molecular and Cellular Endocrinology. 525 (4), 111176 (2021).
- Schneider, H. J., Aimaretti, G., Kreitschmann-Andermahr, I., Stalla, G. K., Ghigo, E. Hypopituitarism. Lancet. 369 (9571), 1461-1470 (2007).
- Fu, Q., et al. The adult pituitary shows stem/progenitor cell activation in response to injury and is capable of regeneration. Endocrinology. 153 (7), 3224-3235 (2012).
- Willems, C., et al. Regeneration in the pituitary after cell-ablation injury: time-related aspects and molecular analysis. Endocrinology. 157 (2), 705-721 (2016).
- Gremeaux, L., Fu, Q., Chen, J., Vankelecom, H. Activated phenotype of the pituitary stem/progenitor cell compartment during the early-postnatal maturation phase of the gland. Stem Cells and Development. 21 (5), 801-813 (2012).
- Zhu, X., Tollkuhn, J., Taylor, H., Rosenfeld, M. G. Notch-dependent pituitary SOX2+ stem cells exhibit a timed functional extinction in regulation of the postnatal gland. Stem Cell Reports. 5 (6), 1196-1209 (2015).
- Russell, J. P., et al. Pituitary stem cells produce paracrine WNT signals to control the expansion of their descendant progenitor cells. eLife. 10 (1), 59142 (2021).
- Vennekens, A., et al. Interleukin-6 is an activator of pituitary stem cells upon local damage, a competence quenched in the aging gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (25), 2100052118 (2021).
- Mertens, F., et al. Pituitary tumors contain a side population with tumor stem cell-associated characteristics. Endocrine-Related Cancer. 22 (4), 481-504 (2015).
- Laporte, E., Vennekens, A., Vankelecom, H. Pituitary remodeling throughout life: are resident stem cells involved. Frontiers in Endocrinology. 11 (1), 604519 (2021).
- Yoshida, S., et al. Isolation of adult pituitary stem/progenitor cell clusters located in the parenchyma of the rat anterior lobe. Stem Cell Research. 17 (2), 318-329 (2016).
- Cox, B., et al. Organoids from pituitary as novel research model to study pituitary stem cell biology. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
- Denef, C., Hautekeete, E., De Wolf, A., Vanderschueren, B. Pituitary basophils from immature male and female rats: distribution of gonadotrophs and thyrotrophs as studied by unit gravity sedimentation. Endocrinology. 130 (3), 724-735 (1978).
- Vander Schueren, B., Denef, C., Cassiman, J. J. Ultrastructural and functional characteristics of rat pituitary cell aggregates. Endocrinology. 110 (2), 513-523 (1982).
- Claes, C., et al. Human stem cell-derived monocytes and microglia-like cells reveal impaired amyloid plaque clearance upon heterozygous or homozygous loss of TREM2. Alzheimer’s and Dementia. 15 (3), 453-464 (2019).
- Trompeter, H. -. I., et al. MicroRNAs miR-26a, miR-26b, and miR-29b accelerate osteogenic differentiation of unrestricted somatic stem cells from human cord blood. BMC Genomics. 14, 111 (2013).
- Suga, H., et al. Self-formation of functional adenohypophysis in three-dimensional culture. Nature. 480 (7375), 57-62 (2011).
- Matsumoto, R., et al. Congenital pituitary hypoplasia model demonstrates hypothalamic OTX2 regulation of pituitary progenitor cells. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 641-654 (2019).
- Kanie, K., et al. Pathogenesis of anti-PIT-1 antibody syndrome: PIT-1 presentation by HLA class I on anterior pituitary cells. Journal of the Endocrine Society. 3 (11), 1969-1978 (2019).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Nolan, L. A., Kavanagh, E., Lightman, S. L., Levy, A. Anterior pituitary cell population control: basal cell turnover and the effects of adrenalectomy and dexamethasone treatment. Journal of Neuroendocrinology. 10 (3), 207-215 (1998).
