Dobbel fargingsmetode for å oppdage pektin i plantesvampinteraksjon

Summary

Denne protokollen beskriver en mikroskopisk metode for å oppdage pektin i kaffe-sopp interaksjon.

Abstract

Planteceller bruker forskjellige strukturelle mekanismer, enten konstituerende eller inducible, for å forsvare seg mot soppinfeksjon. Innkapsling er en effektiv induserbar mekanisme for å isolere sopp haustoria fra plantecelleprotoplasten. Omvendt er pektin, en av de polymere komponentene i celleveggen, et mål for flere pektolytiske enzymer i nekrotrofiske interaksjoner. Her presenteres en protokoll for å oppdage pektin og sopphyphae gjennom optisk mikroskopi. Den pektinrike innkapslingen i kaffecellene som er smittet av rustsvampen Hemileia vastatrix og mesophyllcelleveggmodifiseringen indusert av Cercospora coffeicola undersøkes. Lesjonerte bladprøver ble løst med Karnovsky-løsningen, dehydrert og innebygd i glykolmetakrylat i 2-4 dager. Alle trinnene ble etterfulgt av vakuumpumpende for å fjerne luft i intercellulære rom og forbedre innebyggingsprosessen. De innebygde blokkene ble seksjonert i 5-7 μm tykke seksjoner, som ble avsatt på en glasssklie dekket med vann og deretter oppvarmet ved 40 °C i 30 minutter. Deretter ble lysbildene dobbeltfarget med 5% bomullsblå i laktiofenol for å oppdage sopp og 0,05% ruthenium rød i vann for å oppdage pektin (sure grupper av polyuronsyrer av pektin). Sopp haustoria av Hemileia vastatrix ble funnet å være innkapslet av pektin. Ved kaffe cercosporiosis viste mesofyllceller oppløsning av cellevegger, og intercellulære hyphae og konidiofrener ble observert. Metoden som presenteres her er effektiv for å oppdage en pektin-assosiert respons i plante-sopp interaksjonen.

Introduction

Celleveggforsvarsmekanismer i planter er avgjørende for å begrense soppinfeksjon. Studier har rapportert endringer i celleveggtykkelse og sammensetning siden 1800-tallet ^1,2. Disse endringene kan induseres av et sopppatogen som stimulerer dannelsen av en papilla, som forhindrer sopp i å komme inn i cellen eller kan brukes til å innkapsle hyphae for å isolere vertscellens protoplast fra sopp haustoria. Produksjonen av en dynamisk celleveggbarriere (dvs. papill og et fullt innkapslet haustorium) er viktig for å fremme plantemotstand³. Histopatologiske studier på sopprelaterte sykdommer har undersøkt forekomsten av disse mekanismene og har beskrevet celleveggpolymerer, cellulose, hemicellulose (arabinoxylans) og callose som motstandsmekanismer for soppangrep 4,5,6,7.

Celleveggen er den første barrieren mot mikroorganismeangrep, noe som svekker plantesvampinteraksjonen. Pectic polysakkarider komponerer celleveggen og står for ca 30% av celleveggsammensetningen i primærceller av eudikosplanter der homogalakuronans er den mest tallrike polymeren (omtrent 60%)⁸. Golgi skiller ut komplekse pektinforbindelser som utgjør galaktronsyrekjedene, som kan eller ikke kan metyleres ^8,9. Siden 2012 har litteraturen påpekt at graden av pektinmetylesterifisering er avgjørende for å bestemme kompatibiliteten under infeksjon ved mikrobielle pektiske enzymer 10,11,12. Dermed er protokoller nødvendig for å verifisere tilstedeværelse og distribusjon av pektiske forbindelser i plante-soppbanesystemer.

Ulike teknikker har blitt brukt til å oppdage innkapsling av papill eller haustoria. Referansemetodene som brukes er transmisjonselektronmikroskopi (TEM) av fast vev og lysmikroskopi av levende og faste vev. Når det gjelder TEM, har flere studier vist den strukturelle rollen til celleveggappposisjoner i soppresistens 13,14,15,16, og at bruk av lectins og antistoffer er en intrikat metode for å finne karbohydratpolymerer 16. Studier viser imidlertid at lysmikroskopi er en viktig tilnærming, og at de histokjemiske og immunhiistokjemiske verktøyene gir en bedre forståelse av sammensetningen av papiller og haustorium innkapsling ^6,7.

Patogene sopp viser to hovedtyper av livsstil: biotrofisk og nekrotrofisk. Biotrofiske sopp er avhengige av levende celler for ernæring, mens nekrotrofiske sopp dreper vertscellene, og bor deretter i det døde vevet¹⁷. I Latin-Amerika er kaffeblad rust, forårsaket av sopp hemileia vastatrix, en viktig sykdom i kaffeavlinger^18,19. Hemileia vastatrix presenterer en biotrofisk oppførsel, og blant de strukturelle endringene som observeres i resistente kaffearter eller kultivarer, er det rapportert en overfølsomhetsrespons, avsetning av callose, cellulose og lignin på celleveggene, samt cellehypertrofi¹⁴. Til forfatternes kunnskap rapporterer ikke litteraturen informasjon om betydningen av pektin i kaffe rustmotstand. På den annen side, nekrotrofiske sopp som forårsaker cercosporiosis mål pektin via et sett av enzymer forbundet med cellevegg nedbrytning, som pektinases og polygalacturonase²⁰. Cercosporiosis i kaffe, forårsaket av sopp Cercospora coffeicola er også en stor trussel mot kaffeavlinger^21,22. Denne soppen forårsaker nekrotiske lesjoner i både blader og bær. Etter penetrasjon koloniserer C. coffeicola plantevev gjennom intracellulære og intercellulære veier 23,24,25.

Den nåværende protokollen undersøker tilstedeværelsen av soppstrukturer og pektin på cellevegger. Denne protokollen er nyttig for å identifisere planteresponsen forbundet med pektin (farget med rutheniumrød fargestoff, som er spesifikk for sure grupper av polyuronsyrer av pektin), indusert av verten i en biotrofisk interaksjon med sopp. Det bidrar også til å verifisere effekten av nekrotrofiske sopp på nedbrytning av pektiske cellevegger. De nåværende resultatene indikerer at den doble fargingsmetoden er effektiv for å diskriminere strukturer og reproduksjonsfasen av sopp.

Protocol

1. Utarbeidelse av bufferløsning og reagenser Forbered 2 M kaktokylatbuffer ved å tilsette 4,28 g natriumkakroktylat til 100 ml destillert vann og juster pH til 7,25 med 0,2 N HCl. Forbered 100 ml av Karnovsky-fikseringsløsningen ved å blande 10 ml 25% vandig glutaraldehyd, 10 ml 10% vandig formaldehyd, 25 ml 2 M kaktokylatbuffer og 0,5 ml 0,5 M CaCl226. Utgjør volumet til 100 ml med destillert vann.MERK: Oppløsningen kan oppbevares i kjøl…

Representative Results

Den bomullsblå laktiofenolfargingen på den GMA-innebygde delen avslørte tilstedeværelsen av flere soppstrukturer mellom og inne i kaffemesofyllceller i både biotrofiske og nekrotrofiske soppinteraksjoner. I det biotrofiske patosystemet, når det er farget ved hjelp av dobbeltfargingsmetoden, vises Hemileia vastatrix hyphae som inneholder cellevegger og det tette protoplastinnholdet i mørkeblått i både svampete og palisadeparenchyma (figur 4A<stron…

Discussion

Det nåværende arbeidet introduserer en alternativ dobbeltfarging histokjemisk test for å undersøke pektinsammensetningen av cellevegger som innkapsler haustoria i et biotrofisk patosystem. Målet er også å demonstrere effekten av metoden for å oppdage nekrotrofisk sopp og celleveggendringer indusert av den. Her kan pektin av kaffeparenchyma cellevegger innkapsle både nakken og haustoriumet til rustsvampen Hemileia vastatrix. Silva et al. har også beskrevet innkapsling ved cellulose og callose i kaff…

Materials

Blades DB80 HS	Leica	14035838383	Sectioning
Cacodylate buffer	EMS	# 11652	Fixation
Cotton Blue Lactophenol	Metaquímica	70SOLSIG024629	Staining
Formaldehyde	EMS	#15712	Fixation
Glutaraldehyde	EMS	#16216	Fixation
Historesin Kit	Technovit /EMS	#14653	Historesin for embedding
Hot plate	Dubesser	SSCD25X30-110V	Staining
Microscopy	Zeiss	#490040-0030-000	Image capture
Microtome (Leica RM 2540)	Leica	149BIO000C1 14050238005	Sectioning
Plastic molding cup tray	EMS	10176-30	Staining
Ruthenium red	LABHouse	#006004	Staining
Software Axion Vision	Zeiss	#410130-0909-000	Image capture
Vaccum pump	Prismatec	131 TIPO 2 V.C.	Fixation