Método de coloração dupla para detectar pectina na interação planta-fungo

Summary

Este protocolo descreve um método microscopical para detectar pectina na interação café-fungo.

Abstract

As células vegetais utilizam diferentes mecanismos estruturais, constitutivos ou induíveis, para se defenderem da infecção fúngica. Encapsulamento é um mecanismo indutível eficiente para isolar a haustoria fúngica do protoplasto celular vegetal. Por outro lado, a pectina, um dos componentes poliméricos da parede celular, é alvo de várias enzimas pecotólicas em interações necrotróficas. Aqui, é apresentado um protocolo para detectar pectina e hifas fúngicas através de microscopia óptica. O encapsulamento rico em pectina nas células das folhas de café infectadas pelo fungo ferrugem Hemileia vastatrix e a modificação da parede celular mesófila induzida pelo Cercospora coffeicola são investigados . As amostras de folhas lesionadas foram fixadas com a solução Karnovsky, desidratadas e embutidas em metacrilato glicol por 2-4 dias. Todas as etapas foram seguidas pelo bombeamento a vácuo para remover o ar nos espaços intercelulares e melhorar o processo de incorporação. Os blocos incorporados foram seccionados em seções de 5-7 μm de espessura, que foram depositados em um toboágua de vidro coberto com água e, posteriormente, aquecidos a 40 °C por 30 minutos. Em seguida, os slides foram duplamente manchados com 5% de algodão azul em lactofenol para detectar o fungo e 0,05% vermelho rutênio na água para detectar pectina (grupos ácidos de ácidos poliurônicos de pectina). Haustoria fúngica de Hemileia vastatrix foram encontrados encapsulados por pectina. Na cercosporiose do café, foram observadas células de mesofílico exibindo dissolução de paredes celulares, e hifas intercelulares e conidioforos. O método aqui apresentado é eficaz para detectar uma resposta associada à pectina na interação planta-fungo.

Introduction

Mecanismos de defesa de parede celular nas plantas são cruciais para conter a infecção fúngica. Estudos têm relatado mudanças na espessura e composição da parede celular desde o século^{XIX 1,2}. Essas alterações podem ser induzidas por um patógeno fúngico que estimula a formação de uma papila, que impede que fungos entrem na célula ou possam ser usados para encapsular a hifa para isolar o protoplasto celular hospedeiro da haustoria fúngica. A produção de uma barreira dinâmica de parede celular (ou seja, papila e um haustorium totalmente envolto) é importante para promover a resistência à planta³. Estudos histopatológicos sobre doenças relacionadas ao fungo têm investigado a ocorrência desses mecanismos e descreveram os polímeros de parede celular, celulose, hemicellulose (arabinoxilans), e callose como mecanismos de resistência ao ataque fúngico 4,5,6,7.

A parede celular é a primeira barreira contra o ataque microorganismal, prejudicando a interação planta-fúngica. Polissacarídeos pecéticos compõem a parede celular e respondem por cerca de 30% da composição da parede celular em células primárias de plantas eudicot, nas quais os homogalacturonans são o polímero mais abundante (cerca de 60%)⁸. Os Golgi secretam compostos complexos de pectina que compõem as cadeias de ácido galacturônico, que podem ou não ser metilados ^8,9. Desde 2012, a literatura aponta que o grau de esterificação de metila pectina é fundamental para determinar a compatibilidade durante a infecção por enzimas pecíticas microbianas 10,11,12. Assim, são necessários protocolos para verificar a presença e distribuição de compostos pecticos em sistemas de pathos vegetais-fúngicos.

Várias técnicas têm sido usadas para detectar o encapsulamento de papilas ou haustoria. Os métodos de referência utilizados são a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de tecido fixo e microscopia leve de tecidos vivos e fixos. Em relação ao TEM, diversos estudos têm demonstrado o papel estrutural das apposições de parede celular na resistência fúngica 13,14,15,16, e que o uso de lectinas e anticorpos é um método intrincado para localizar polímeros de carboidratos 16. No entanto, estudos mostram que a microscopia leve é uma abordagem importante e que as ferramentas histoquímicas e imunohistoquímicas permitem uma melhor compreensão da composição da papila e do haustorium^{encasement 6,7}.

Os fungos patogênicos apresentam dois tipos principais de estilos de vida: biotrófico e necrotrófico. Fungos biotróficos dependem de células vivas para sua nutrição, enquanto fungos necrotróficos matam as células hospedeiras, e depois vivem nos tecidos mortos¹⁷. Na América Latina, a ferrugem da folha de café, causada pelo fungo Hemileia vastatrix, é uma doença importante nas culturas de café^18,19. A hemileia vastatrix apresenta um comportamento biotrófico e, entre as alterações estruturais observadas em espécies ou cultivares de café resistentes, foi relatada uma resposta de hipersensibilidade, deposição de calose, celulose e lignina nas paredes celulares, bem como hipertrofia^{celular 14}. Para o conhecimento dos autores, a literatura não informa informações sobre a importância da pectina na resistência à ferrugem do café. Por outro lado, fungos necrotróficos que causam a cercosporiose visam a pectina através de um conjunto de enzimas associadas à degradação da parede celular, como pectinases e poligalacturonase²⁰. A cercosporiose no café, causada pelo fungo Cercospora coffeicola, também é uma grande ameaça às culturas de café^21,22. Este fungo causa lesões necróticas em folhas e frutos. Após a penetração, C. coffeicola coloniza tecidos vegetais através de vias intracelulares e intercelulares 23,24,25.

O presente protocolo investiga a presença de estruturas fúngicas e pectina nas paredes celulares. Este protocolo é útil para identificar a resposta vegetal associada à pectina (manchada com corante vermelho rutênio, que é específica para grupos ácidos de ácidos poliurônicos de pectina), induzida pelo hospedeiro em uma interação biotrófica com fungo. Também ajuda a verificar o efeito de fungos necrotróficos na degradação das paredes das células pecíticas. Os resultados atuais indicam que o método de dupla coloração é eficaz para discriminar estruturas e a fase reprodutiva dos fungos.

Protocol

1. Preparação da solução de tamponamento e reagentes Prepare 2 M tampão de cacodilato adicionando 4,28 g de cacodilato de sódio a 100 mL de água destilada e ajuste o pH para 7,25 com 0,2 N HCl. Prepare 100 mL da solução fixada Karnovsky misturando 10 mL de glutaraldeído aquoso de 25%, 10 mL de formaldeído aquoso de 10%, 25 mL de tampão de cacodilato de 2 M e 0,5 mL de 0,5 M CaCl226. Coma o volume até 100 mL com água destilada.NOTA: …

Representative Results

A coloração de lactofenol azul de algodão na seção incorporada pela GMA revelou a presença de várias estruturas fúngicas entre e dentro de células de mesófilo de café em interações fúnequias biotróficas e nefróficas. No pathosystem biotrófico, quando manchado usando o método de coloração dupla, hemileia vastatrix hiphae contendo paredes celulares e o denso teor de protoplasto aparecem em azul escuro em parenchyma esponjoso e palisade (Figura 4A…

Discussion

O presente trabalho introduz um teste histoquímico alternativo de dupla coloração para investigar a composição da pectina das paredes celulares que encapsula a haustoria em um pathosystem biotrófico. O objetivo também é demonstrar a eficácia do método para detectar fungos necrotróficos e alterações na parede celular induzidas por ele. Aqui, a pectina das paredes celulares do café parenchyma pode encapsular tanto o pescoço quanto o haustorium do fungo ferrugem Hemileia vastatrix. Silva et al. tamb?…

Materials

Blades DB80 HS	Leica	14035838383	Sectioning
Cacodylate buffer	EMS	# 11652	Fixation
Cotton Blue Lactophenol	Metaquímica	70SOLSIG024629	Staining
Formaldehyde	EMS	#15712	Fixation
Glutaraldehyde	EMS	#16216	Fixation
Historesin Kit	Technovit /EMS	#14653	Historesin for embedding
Hot plate	Dubesser	SSCD25X30-110V	Staining
Microscopy	Zeiss	#490040-0030-000	Image capture
Microtome (Leica RM 2540)	Leica	149BIO000C1 14050238005	Sectioning
Plastic molding cup tray	EMS	10176-30	Staining
Ruthenium red	LABHouse	#006004	Staining
Software Axion Vision	Zeiss	#410130-0909-000	Image capture
Vaccum pump	Prismatec	131 TIPO 2 V.C.	Fixation