Doppelfärbungsmethode zum Nachweis von Pektin in der Pflanzen-Pilz-Interaktion

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine mikroskopische Methode zum Nachweis von Pektin in der Kaffee-Pilz-Interaktion.

Abstract

Pflanzenzellen nutzen verschiedene strukturelle Mechanismen, entweder konstitutiv oder induzierbar, um sich vor einer Pilzinfektion zu schützen. Die Verkapselung ist ein effizienter induzierbarer Mechanismus, um die pilzliche Haustoria aus dem pflanzlichen Zell-Protoplasten zu isolieren. Umgekehrt ist Pektin, einer der polymeren Bestandteile der Zellwand, ein Ziel mehrerer pektolytischer Enzyme in nekrotrophen Wechselwirkungen. Hier wird ein Protokoll zum Nachweis von Pektin und Pilzhyphen durch optische Mikroskopie vorgestellt. Untersucht werden die pektinreiche Verkapselung in den Zellen von Kaffeeblättern, die mit dem Rostpilz Hemileia vastatrix infiziert sind, und die durch Cercospora coffeicola induzierte Mesophyll-Zellwandmodifikation . Läsionierte Blattproben wurden mit der Karnovsky-Lösung fixiert, dehydriert und für 2-4 Tage in Glykolmethacrylat eingebettet. Auf alle Schritte folgte ein Vakuumpumpen, um Luft in den Interzellularräumen zu entfernen und den Einbettungsprozess zu verbessern. Die eingebetteten Blöcke wurden in 5-7 μm dicke Abschnitte geschnitten, die auf einem mit Wasser bedeckten Glasobjektträger abgeschieden und anschließend 30 min lang auf 40 °C erhitzt wurden. Als nächstes wurden die Objektträger mit 5% Baumwollblau in Lactophenol doppelt gefärbt, um den Pilz nachzuweisen, und 0,05% Rutheniumrot in Wasser, um Pektin (saure Gruppen von Polyuronsäuren von Pektin) nachzuweisen. Es wurde festgestellt, dass pilzartige Haustorien von Hemileia vastatrix von Pektin eingekapselt sind. Bei der Kaffeezerkosporiose zeigten Mesophyllzellen eine Auflösung der Zellwände, und interzelluläre Hyphen und Konidiophoren wurden beobachtet. Die hier vorgestellte Methode ist effektiv, um eine Pektin-assoziierte Reaktion in der Pflanzen-Pilz-Interaktion nachzuweisen.

Introduction

Zellwand-Abwehrmechanismen in Pflanzen sind entscheidend, um Pilzinfektionen einzudämmen. Studien haben über Veränderungen der Zellwanddicke und -zusammensetzung seit dem 19^{. Jahrhundert} berichtet ^1,2. Diese Veränderungen können durch einen pilzlichen Krankheitserreger induziert werden, der die Bildung einer Papille stimuliert, die verhindert, dass Pilze in die Zelle eindringen, oder könnte verwendet werden, um die Hyphen zu verkapseln, um den Wirtszellprotoplast von der pilzlichen Haustoria zu isolieren. Die Herstellung einer dynamischen Zellwandbarriere (d.h. Papillen und ein vollständig ummanteltes Haustorium) ist wichtig, um die Pflanzenresistenz zu fördern³. Histopathologische Studien zu pilzbedingten Erkrankungen haben das Auftreten dieser Mechanismen untersucht und die Zellwandpolymere Cellulose, Hemicellulose (Arabinoxylane) und Callose als Resistenzmechanismen gegen Pilzbefall^beschrieben 4,5,6,7.

Die Zellwand ist die erste Barriere gegen mikroorganismische Angriffe und beeinträchtigt die Pflanzen-Pilz-Interaktion. Pektische Polysaccharide bilden die Zellwand und machen etwa 30% der Zellwandzusammensetzung in Primärzellen von Eudicot-Pflanzen aus, in denen Homogalacturonen das am häufigsten vorkommende Polymer sind (etwa 60%)⁸. Der Golgi sezerniert komplexe Pektinverbindungen, die die galakturonischen Säureketten umfassen, die methyliert sein können oder nicht ^8,9. Seit 2012 weist die Literatur darauf hin, dass der Grad der Pektinmethylveresterung entscheidend für die Bestimmung der Verträglichkeit während der Infektion mit mikrobiellen pektischen Enzymen^10,11,12 ist. Daher sind Protokolle erforderlich, um das Vorhandensein und die Verteilung von pektischen Verbindungen in pflanzlich-pilzlichen Pathosystemen zu überprüfen.

Verschiedene Techniken wurden verwendet, um die Verkapselung von Papillen oder Haustorien nachzuweisen. Die verwendeten Referenzmethoden sind die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) von festsitzendem Gewebe und die Lichtmikroskopie von lebendem und fixiertem Gewebe. In Bezug auf TEM haben mehrere Studien die strukturelle Rolle von Zellwandappositionen bei der Pilzresistenz 13,14,15,16 gezeigt und dass die Verwendung von Lektinen und Antikörpern eine komplizierte Methode ist^, um Kohlenhydratpolymere zu lokalisieren ¹⁶. Studien zeigen jedoch, dass die Lichtmikroskopie ein wichtiger Ansatz ist und dass die histochemischen und immunhistochemischen Werkzeuge ein besseres Verständnis der Zusammensetzung von Papillen und Haustoriumhülle^{ermöglichen 6,7}.

Pathogene Pilze zeigen zwei Haupttypen von Lebensstilen: biotrophe und nekrotrophe. Biotrophe Pilze sind für ihre Ernährung auf lebende Zellen angewiesen, während nekrotrophe Pilze die Wirtszellen töten und dann in den toten Geweben leben¹⁷. In Lateinamerika ist Kaffeeblattrost, verursacht durch den Pilz Hemileia vastatrix, eine wichtige Krankheit bei Kaffeepflanzen^18,19. Hemileia vastatrix zeigt ein biotrophes Verhalten, und unter den strukturellen Veränderungen, die bei resistenten Kaffeespezies oder -sorten beobachtet wurden, wurden eine Überempfindlichkeitsreaktion, Ablagerungen von Callose, Cellulose und Lignin an den Zellwänden sowie Zellhypertrophie¹⁴ berichtet. Nach Kenntnis der Autoren berichtet die Literatur nicht über die Bedeutung von Pektin bei der Kaffeerostbeständigkeit. Auf der anderen Seite zielen nekrotrophe Pilze, die Zerkosporiose verursachen, auf Pektin über eine Reihe von Enzymen, die mit dem Zellwandabbau assoziiert sind, wie Pektinas und Polygalacturonase²⁰. Zerkosporiose im Kaffee, verursacht durch den Pilz Cercospora coffeicola ist auch eine große Bedrohung für Kaffeepflanzen^21,22. Dieser Pilz verursacht nekrotische Läsionen sowohl in Blättern als auch in Beeren. Nach der Penetration besiedelt C. coffeicola Pflanzengewebe über intrazelluläre und interzelluläre Wege^23,24,25.

Das vorliegende Protokoll untersucht das Vorhandensein von Pilzstrukturen und Pektin an den Zellwänden. Dieses Protokoll ist nützlich, um die Pflanzenreaktion zu identifizieren, die mit Pektin (mit rutheniumrotem Farbstoff gefärbt, der spezifisch für saure Gruppen von Polyuronsäuren von Pektin ist) verbunden ist, die vom Wirt in einer biotrophen Wechselwirkung mit Pilzen induziert wird. Es hilft auch, die Wirkung von nekrotrophen Pilzen auf den Abbau von pektischen Zellwänden zu überprüfen. Die vorliegenden Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Doppelfärbungsmethode wirksam ist, um Strukturen und die Fortpflanzungsphase von Pilzen zu unterscheiden.

Protocol

1. Herstellung der Pufferlösung und der Reagenzien Bereiten Sie 2 M Cacodylatpuffer vor, indem Sie 4,28 g Natriumcacodylat zu 100 ml destilliertem Wasser hinzufügen und den pH-Wert mit 0,2 N HCl auf 7,25 einstellen. Bereiten Sie 100 ml der Karnovsky-Fixierlösung vor, indem Sie 10 ml 25% wässriges Glutaraldehyd, 10 ml 10% wässriges Formaldehyd, 25 ml 2 M Cacodylatpuffer und 0,5 ml 0,5 M CaCl2 26 mischen. Erhöhen Sie das Volumen mit destilliertem…

Representative Results

Die baumwollblaue Lactophenolfärbung auf dem GMA-eingebetteten Abschnitt zeigte das Vorhandensein mehrerer Pilzstrukturen zwischen und in Kaffeemesophyllzellen sowohl in biotrophen als auch in nekrotrophen Pilzinteraktionen. Im biotrophen Pathosystem erscheinen Hemileia vastatrix-Hyphen mit Zellwänden und der dichte Protoplastengehalt bei der Färbung mit der Doppelfärbungsmethode sowohl im schwammigen als auch im Palisadenparenchym dunkelblau (Abbildung</stron…

Discussion

Die vorliegende Arbeit stellt einen alternativen histochemischen Test zur Doppelfärbung vor, um die Pektinzusammensetzung von Zellwänden zu untersuchen, die Haustoria in einem biotrophen Pathosystem verkapseln. Ziel ist es auch, die Wirksamkeit der Methode zum Nachweis von nekrotrophen Pilzen und dadurch induzierten Zellwandveränderungen nachzuweisen. Hier kann Pektin der Kaffeeparenchym-Zellwände sowohl den Hals als auch das Haustorium des Rostpilzes Hemileia vastatrix verkapseln. Silva et al. haben auch di…

Materials

Blades DB80 HS	Leica	14035838383	Sectioning
Cacodylate buffer	EMS	# 11652	Fixation
Cotton Blue Lactophenol	Metaquímica	70SOLSIG024629	Staining
Formaldehyde	EMS	#15712	Fixation
Glutaraldehyde	EMS	#16216	Fixation
Historesin Kit	Technovit /EMS	#14653	Historesin for embedding
Hot plate	Dubesser	SSCD25X30-110V	Staining
Microscopy	Zeiss	#490040-0030-000	Image capture
Microtome (Leica RM 2540)	Leica	149BIO000C1 14050238005	Sectioning
Plastic molding cup tray	EMS	10176-30	Staining
Ruthenium red	LABHouse	#006004	Staining
Software Axion Vision	Zeiss	#410130-0909-000	Image capture
Vaccum pump	Prismatec	131 TIPO 2 V.C.	Fixation