संयंत्र-कवक इंटरैक्शन में पेक्टिन का पता लगाने के लिए डबल-स्टेनिंग विधि
Summary
यह प्रोटोकॉल कॉफी-कवक इंटरैक्शन में पेक्टिन का पता लगाने के लिए एक माइक्रोस्कोपिक विधि का वर्णन करता है।
Abstract
पौधे की कोशिकाएं फंगल संक्रमण से खुद को बचाने के लिए विभिन्न संरचनात्मक तंत्रों का उपयोग करती हैं, या तो संवैधानिक या अपरिवर्तनीय। Encapsulation संयंत्र सेल protoplast से कवक haustoria को अलग करने के लिए एक कुशल inducible तंत्र है। इसके विपरीत, पेक्टिन, सेल की दीवार के बहुलक घटकों में से एक, नेक्रोट्रॉफिक इंटरैक्शन में कई पेक्टोलाइटिक एंजाइमों का लक्ष्य है। यहां, ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से पेक्टिन और फंगल हाइफे का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। जंग कवक Hemileia vastatrix और Mesophyll सेल दीवार संशोधन Cercospora coffeicola द्वारा प्रेरित द्वारा संक्रमित कॉफी पत्तियों की कोशिकाओं में पेक्टिन समृद्ध encapsulation की जांच कर रहे हैं. घाव वाले पत्ती के नमूनों को कार्नोव्स्की समाधान के साथ तय किया गया था, निर्जलित किया गया था, और 2-4 दिनों के लिए ग्लाइकोल मेथाक्रिलेट में एम्बेडेड किया गया था। अंतरकोशिकीय रिक्त स्थान में हवा को हटाने और एम्बेडिंग प्रक्रिया में सुधार करने के लिए वैक्यूम-पंपिंग द्वारा सभी चरणों का पालन किया गया था। एम्बेडेड ब्लॉकों को 5-7 μm मोटे वर्गों में विभाजित किया गया था, जिन्हें पानी से ढके हुए ग्लास स्लाइड पर जमा किया गया था और बाद में 30 मिनट के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर गर्म किया गया था। इसके बाद, स्लाइड को कवक का पता लगाने के लिए लैक्टोफेनोल में 5% कपास नीले रंग के साथ डबल-दाग दिया गया था और पेक्टिन (पेक्टिन के पॉलीयूरोनिक एसिड के अम्लीय समूह) का पता लगाने के लिए पानी में 0.05% रूथेनियम लाल था। हेमिलिया वास्टाट्रिक्स के फंगल हौस्टोरिया को पेक्टिन द्वारा समझाया गया पाया गया था। कॉफी cercosporiosis में, मेसोफिल कोशिकाओं ने सेल की दीवारों के विघटन का प्रदर्शन किया, और अंतरकोशिकीय हाइफे और कोनिडियोफोर देखे गए। यहां प्रस्तुत विधि पौधे-कवक बातचीत में पेक्टिन से जुड़ी प्रतिक्रिया का पता लगाने के लिए प्रभावी है।
Introduction
कवक संक्रमण को रोकने के लिए पौधों में सेल की दीवार रक्षा तंत्र महत्वपूर्ण हैं। अध्ययनों ने 19वीं शताब्दी 1,2 के बाद से सेल की दीवार की मोटाई और संरचना में परिवर्तनकी सूचना दी है। इन परिवर्तनों को एक कवक रोगज़नक़ द्वारा प्रेरित किया जा सकता है जो एक पैपिला के गठन को उत्तेजित करता है, जो कवक को सेल में प्रवेश करने से रोकता है या इसका उपयोग फंगल हौस्टोरिया से मेजबान सेल प्रोटोप्लास्ट को अलग करने के लिए हाइफे को समाहित करने के लिए किया जा सकता है। एक गतिशील सेल दीवार बाधा का उत्पादन (यानी, पैपिले और एक पूरी तरह से encased haustorium) संयंत्र प्रतिरोध3 को बढ़ावा देने के लिए महत्वपूर्ण है। कवक से संबंधित बीमारियों पर हिस्टोपैथोलॉजिकल अध्ययनों ने इन तंत्रों की घटना की जांच की है और सेल की दीवार पॉलिमर, सेल्यूलोज, हेमीसेल्युलोज (अरबिनोक्सिलन्स), और कैलोज़ को फंगल हमले के प्रतिरोध तंत्र के रूप में वर्णित कियाहै 4,5,6,7।
सेल की दीवार सूक्ष्मजीवीय हमले के खिलाफ पहली बाधा है, जो पौधे-कवक बातचीत को खराब करती है। पेक्टिक पॉलीसेकेराइड सेल की दीवार की रचना करते हैं और यूडिकोट पौधों की प्राथमिक कोशिकाओं में सेल की दीवार संरचना के लगभग 30% के लिए खाते हैं जिसमें होमोगैलेक्टुरोनन सबसे प्रचुर मात्रा में बहुलक (लगभग 60%) हैं। गोल्गी जटिल पेक्टिन यौगिकों का स्राव करता है जिसमें गैलेक्टुरोनिक एसिड चेन शामिल होते हैं, जिन्हेंमिथाइलेटेड 8,9 हो सकता है या नहीं भी हो सकता है। 2012 के बाद से, साहित्य ने बताया है कि पेक्टिन मिथाइल एस्टरिफिकेशन की डिग्री माइक्रोबियल पेक्टिक एंजाइमों द्वारा संक्रमण के दौरान संगतता का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है10,11,12। इस प्रकार, पौधे-कवक पैथोसिस्टम में पेक्टिक यौगिकों की उपस्थिति और वितरण को सत्यापित करने के लिए प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है।
पैपिले या हॉस्टोरिया के एनकैप्सुलेशन का पता लगाने के लिए विभिन्न तकनीकों का उपयोग किया गया है। उपयोग की जाने वाली संदर्भ विधियां निश्चित ऊतकों की संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) और जीवित और स्थिर ऊतकों की प्रकाश माइक्रोस्कोपी हैं। टीईएम के बारे में, कई अध्ययनों ने फंगल प्रतिरोध 13,14,15,16 में सेल दीवार एपोज़िशन की संरचनात्मक भूमिका का प्रदर्शन किया है, और लेक्टिन और एंटीबॉडी का उपयोग कार्बोहाइड्रेट पॉलिमर16 का पता लगाने के लिए एक जटिल विधि है। हालांकि, अध्ययनों से पता चलता है कि प्रकाश माइक्रोस्कोपी एक महत्वपूर्ण दृष्टिकोण है और हिस्टोकेमिकल और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल उपकरण पैपिले और हॉस्टोरियम एनकेसमेंट 6,7 की संरचना की बेहतर समझ की अनुमति देते हैं।
रोगजनक कवक जीवन शैली के दो मुख्य प्रकार दिखाते हैं: बायोट्रॉफिक और नेक्रोट्रॉफिक। बायोट्रॉफिक कवक अपने पोषण के लिए जीवित कोशिकाओं पर निर्भर करते हैं जबकि नेक्रोट्रॉफिक कवक मेजबान कोशिकाओं को मारते हैं, और फिरमृत ऊतकों में रहते हैं। लैटिन अमेरिका में, कॉफी पत्ती जंग, कवक Hemileia vastatrix के कारण, कॉफी फसलों में एक महत्वपूर्ण बीमारी है18,19. Hemileia vastatrix एक biotrophic व्यवहार प्रस्तुत करता है और, प्रतिरोधी कॉफी प्रजातियों या cultivars में मनाया संरचनात्मक परिवर्तनों के बीच, एक अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रिया, सेलोस, सेल्यूलोज, और सेल की दीवारों पर लिग्निन के जमाव, साथ ही साथ सेल hypertrophy14 की सूचना दी गई है। लेखकों के ज्ञान के लिए, साहित्य कॉफी जंग प्रतिरोध में पेक्टिन के महत्व पर जानकारी की रिपोर्ट नहीं करता है। दूसरी ओर, नेक्रोट्रोफिक कवक जो सेरकोस्पोरियोसिस का कारण बनता है, सेल की दीवार गिरावट से जुड़े एंजाइमों के एक सेट के माध्यम से पेक्टिन को लक्षित करता है, जैसे कि पेक्टिनेस और पॉलीगैलेक्टुरोनेज20। कवक के कारण कॉफी में Cercosporiosis Cercospora coffeicola भी कॉफी फसलों के लिए एक बड़ा खतरा है21,22. यह कवक पत्तियों और जामुन दोनों में परिगलित घावों का कारण बनता है। प्रवेश के बाद, C. c. coffeicola इंट्रासेल्युलर और इंटरसेलुलर मार्गों23,24,25 के माध्यम से पौधे के ऊतकों का उपनिवेश करता है।
वर्तमान प्रोटोकॉल सेल की दीवारों पर कवक संरचनाओं और पेक्टिन की उपस्थिति की जांच करता है। यह प्रोटोकॉल पेक्टिन से जुड़ी पौधों की प्रतिक्रिया की पहचान करने के लिए उपयोगी है (रूथेनियम लाल डाई के साथ दाग, जो पेक्टिन के पॉलीयूरोनिक एसिड के अम्लीय समूहों के लिए विशिष्ट है), कवक के साथ बायोट्रोफिक इंटरैक्शन में मेजबान द्वारा प्रेरित। यह पेक्टिक सेल दीवारों के क्षरण पर नेक्रोट्रोफिक कवक के प्रभाव को सत्यापित करने में भी मदद करता है। वर्तमान परिणाम इंगित करते हैं कि डबल स्टेनिंग विधि संरचनाओं और कवक के प्रजनन चरण में भेदभाव करने के लिए प्रभावी है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान कार्य सेल की दीवारों की पेक्टिन संरचना की जांच करने के लिए एक वैकल्पिक डबल-स्टेनिंग हिस्टोकेमिकल परीक्षण का परिचय देता है जो एक बायोट्रोफिक पैथोसिस्टम में हॉस्टोरिया को समाहित करता है। इसका …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इस काम को विकसित करने के लिए समर्थन के लिए डॉ हडसन डब्ल्यू पी डी कार्वाल्हो को धन्यवाद देना चाहते हैं। लेखक भी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की प्रयोगशाला के आभारी हैं “प्रोफेसर इलियट वातानाबे किताजिमा” प्रकाश माइक्रोस्कोपी सुविधा प्रदान करने के लिए। लेखकों ने घावों के साथ पौधे की सामग्री की आपूर्ति के लिए डॉ फ्लाविया रोड्रिग्स अल्वेस पैट्रिसियो को धन्यवाद दिया।
Materials
| Blades DB80 HS | Leica | 14035838383 | Sectioning |
| Cacodylate buffer | EMS | # 11652 | Fixation |
| Cotton Blue Lactophenol | Metaquímica | 70SOLSIG024629 | Staining |
| Formaldehyde | EMS | #15712 | Fixation |
| Glutaraldehyde | EMS | #16216 | Fixation |
| Historesin Kit | Technovit /EMS | #14653 | Historesin for embedding |
| Hot plate | Dubesser | SSCD25X30-110V | Staining |
| Microscopy | Zeiss | #490040-0030-000 | Image capture |
| Microtome (Leica RM 2540) | Leica | 149BIO000C1 14050238005 | Sectioning |
| Plastic molding cup tray | EMS | 10176-30 | Staining |
| Ruthenium red | LABHouse | #006004 | Staining |
| Software Axion Vision | Zeiss | #410130-0909-000 | Image capture |
| Vaccum pump | Prismatec | 131 TIPO 2 V.C. | Fixation |
References
- deBary, A. Research on the development of some parasitic fungi. Annals of Natural Sciences. Botany and Plant Biology. 20, 5 (1863).
- Mangin, L. Research on the Peronospores. Bulletin of the Natural History Society of Autun. 8, 55-108 (1895).
- Underwood, W. The plant cell wall: a dynamic barrier against pathogen invasion. Frontiers in Plant Science. 3 (85), 1-6 (2012).
- Hückelhoven, R. Cell wall-associated mechanisms of disease resistance and susceptibility. Annual Review of Phytopathology. 45, 101-127 (2007).
- Voigt, C. A. Callose-mediated resistance to pathogenic intruders in plant defense-related papillae. Frontiers in Plant Science. 5 (168), 1-6 (2014).
- Chowdhury, J., et al. Differential accumulation of callose, arabinoxylan and cellulose in nonpenetrated versus penetrated papillae on leaves of barley infected with Blumeria graminis f. sp. Hordei. New Phytologist. 204 (3), 650-660 (2014).
- Marques, J. P. R., et al. Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum. Frontiers in Plant Science. 9 (698), 1-14 (2018).
- Caffall, K. H., Mohnen, D. The structure, function, and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides. Carbohydrate Research. 344, 1879-1900 (2009).
- Carpita, N. C., Ralph, J., McCann, M. C. The cell wall. Biochemistry and Molecular Biology of Plants., 2nd Edition. , 45 (2015).
- Lionetti, V., Cervone, F., Bellincampi, D. Methyl esterification of pectin plays a role during plant-pathogen interactions and affects plant resistance to diseases. Journal of Plant Physiology. 169 (16), 1623-1630 (2012).
- Lionetti, V. Pectoplate: the simultaneous phenotyping of pectin methylesterases, pectinases, and oligogalacturonides in plants during biotic stresses. Frontiers in Plant Science. 6 (331), 1-8 (2015).
- Lionetti, V., et al. Three pectin methylesterase inhibitors protect cell wall integrity for Arabidopsis immunity to Botrytis. Plant Physiology. 173 (3), 1844-1863 (2017).
- Heath, M. C. Haustorium sheath formation in cowpea leaves immune to rust infection. Phytopathology. 61, 383-388 (1971).
- Silva, M. C., et al. Coffee resistance to the main diseases: leaf rust and coffee berry disease. Brazilian Journal of Plant Physiology. 18 (1), 119-147 (2006).
- An, P., Li, X., Zheng, Y., Eneji, A. E., Inanaga, S. Calcium effects on root cell wall composition and ion contents in two soybean cultivars under salinity stress. Canadian Journal of Plant Science. 94 (4), 733-740 (2014).
- Marques, J. P. R., et al. Sugarcane smut: shedding light on the development of the whip-shaped sorus. Annals of Botany. 119 (5), 815-827 (2017).
- Delaye, L., García-Guzmán, G., Heil, M. Endophytes versus biotrophic and necrotrophic pathogens-are fungal lifestyles evolutionarily stable traits. Fungal Diversity. 60 (1), 125-135 (2013).
- Avelino, J., et al. The coffee rust crises in Colombia and Central America (2008-2013): impacts, plausible causes and proposed solutions. Food Security. 7, 303-321 (2015).
- Zambolim, L. Current status and management of coffee leaf rust in Brazil. Tropical Plant Pathology. 41, 1-8 (2016).
- Swiderska-Burek, U., et al. Phytopathogenic Cercosporoidfungi-from taxonomy to modern biochemistry and molecular biology. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8555 (2020).
- Andrade, C. C. L., et al. Infection process and defense response of two distinct symptoms of Cercospora leaf spot in coffee leaves. Phytoparasitica. 49 (7), 727-737 (2021).
- Zambolim, L. Coffee tree diseases. Handbook of Phytopathology: Diseases of cultivated plants. 5th ed. , 810 (2016).
- Castaño, A. J. J. Coffee rust. Informative report Cenicafé. 82, 313-327 (1956).
- Echandi, E. Coffee rust, caused by the fungus Cercospora coffeicola. Turrialba. 9 (2), 54-67 (1959).
- Souza, A. G. C., Rodrigues, F. A., Maffia, L. A., Mizubuti, E. S. G. Infection process of Cercospora coffeicola on coffee leaf. Journal of Phytopathology. 159 (1), 6-11 (2011).
- Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).
- Hoagland, D. R., Arnon, D. I. The water-culture method for growing plants without soil. College of Agriculture, Agricultural Experiment Station. , 347 (1950).
- Eskes, A. B. Resistance. Coffee rust: epidemiology, resistance and management. 1, 171 (1989).
- Silva, M. C., Nicole, M., Rijo, L., Geiger, J. P., Rodrigues, C. G. Cytochemical aspects of the plant-rust fungus interface during the compatible interaction Coffea arabica (cv. Caturra)-Hemileia vastatrix (race III). International Journal of Plant Sciences. 160 (1), 79-91 (1999).
- Alves, R. F., Marques, J. P. R., Apezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Process of infection and colonization of Pseudocercospora kaki in persimmon leaves. Journal of Phytopathology. 169 (3), 168-175 (2020).
- Hayat, M. A. . Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications, Vol. 1. , 564 (1981).
- Paiva, E. A. S., Pinho, S. Z., Oliveira, D. M. T., Chiarini-Garcia, H., Melo, R. C. N. Large plant samples: how to process for GMA embedding. Light microscopy: methods and protocols. 689, 37-49 (2011).
- Marques, J. P. R., Soares, M. K. M., Appezzato-da-Glória, B. New staining technique for fungal-infected plant tissues. Turkish Journal of Botany. 37 (4), 784-787 (2013).
- Schuller, A., Ludwig-Müller, J. Histological methods to detect the clubroot pathogen Plasmodiophora brassicae during its complex life cycle. Plant Pathology. 65 (8), 1223-1237 (2016).
- Braga, Z. V., Santos, R. F., Amorim, L., Appezzato-da-Glória, B. Histopathological evidence of concomitant sexual and asexual reproduction of Elsinoë ampelina in grapevine under subtropical climate. Physiological and Molecular Plant Pathology. 111, 101517 (2020).
- Marques, J. P. R., Soares, M. K. M., Piracicaba, F. E. A. L. Q. . Manual of Techniques Applied to Plant Histopathology. , 140 (2021).
- Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera. European Journal of Plant Pathology. 154, 1185-1193 (2019).
- Chesters, C. G. C. Three methods of using cotton blue as a mycological stain. Annals of Botany. 48 (3), 820-822 (1934).
- Macedo, N. A. Manual of Techniques in Plant Histology. Feira de Santana: State University of Feira de Santana. , 68 (1997).
- Lecker, A. Preparation of lactophenol cotton blue slide mounts. Community Eye Health Journal. 12 (30), 24 (1999).
- Whitakaer, F. C. S., Denison, F. C. S. Lactic acid in wool dyeing. Journal of the Society of Dyers and Colourists. 98, 103 (1895).
- Chamberlain, C. J. . Methods in Plant Histology. , 349 (1932).
- Sterling, C. Crystal-structure of ruthenium red and stereochemistry of its pectin stain. American Journal of Botany. 57, 172-175 (1970).
- Luft, J. H. Ruthenium red and violet. 1. Chemistry, purification, methods of use for electron microscopy and mechanism of action. The Anatomical Record. 171 (3), 347-368 (1971).
- Buckeridge, M. S., Cavalari, A. A., Silva, G. B. D. A., Kerbauy, G. B. Cell Wall. Plant Physiology. , 165-181 (2013).
