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Biologie

식물 - 곰팡이 상호 작용에서 펙틴을 검출하는 이중 염색 방법

Published: February 04, 2022
doi:
10.3791/63432
,
1Faculty of Animal Science and Food Engineering, Department of Basic Sciences,University of São Paulo, 2Laboratory of Nuclear Instrumentation, Center of Nuclear Energy in Agriculture,University of São Paulo

Summary

이 프로토콜은 커피-곰팡이 상호작용에서 펙틴을 검출하는 현미경 방법을 기술한다.

Abstract

식물 세포는 곰팡이 감염으로부터 자신을 방어하기 위해 구성 적 또는 유도성 인 다른 구조적 메커니즘을 사용합니다. 캡슐화는 식물 세포 원형질체로부터 진균성 하우스토리아를 분리하는 효율적인 유도성 메카니즘이다. 반대로, 세포벽의 고분자 성분 중 하나 인 펙틴은 괴사 성 상호 작용에서 여러 펙톨리아 효소의 표적입니다. 여기에서, 광학 현미경을 통해 펙틴 및 진균 균사를 검출하는 프로토콜이 제시된다. 녹균인 헤밀리아 바스타트릭 스에 의해 감염된 커피 잎의 세포에서 펙틴이 풍부한 캡슐화와 세르코스포라 코페이콜라 에 의해 유도된 중엽 세포벽 변형이 조사된다. Lesioned 잎 샘플을 Karnovsky 용액으로 고정시키고, 탈수시키고, 2-4일 동안 글리콜 메타크릴레이트에 포매하였다. 모든 단계는 세포간 공간에서 공기를 제거하고 매립 과정을 개선하기 위해 진공 펌핑으로 이어졌다. 매립된 블록을 5-7 μm 두께의 섹션으로 절편화하고, 물로 덮인 유리 슬라이드 상에 증착시키고, 이어서 40°C에서 30분 동안 가열하였다. 다음으로, 슬라이드를 락토페놀 중의 5% 코튼 블루로 이중 염색하여 곰팡이를 검출하고, 물에서 0.05% 루테늄 레드로 염색하여 펙틴(펙틴의 폴리우론산의 산성기)을 검출하였다. Hemileia vastatrix 의 곰팡이 haustoria는 펙틴에 의해 캡슐화 된 것으로 밝혀졌습니다. 커피 자궁 경부증에서 중엽 세포는 세포벽의 용해를 나타 냈으며 세포 간 균사와 conidiophores가 관찰되었습니다. 여기에 제시된 방법은 식물-진균 상호작용에서 펙틴-관련 반응을 검출하는데 효과적이다.

Introduction

식물의 세포벽 방어 메커니즘은 곰팡이 감염을 억제하는 데 중요합니다. 연구에 따르면 19세기 1,2 이후 세포벽 두께와 조성의 변화가보고되었습니다. 이러한 변화는 유두의 형성을 자극하는 곰팡이 병원체에 의해 유도 될 수 있으며, 이는 곰팡이가 세포에 들어가는 것을 방지하거나 진균 성 하우스토리아에서 숙주 세포 원형질체를 분리하기 위해 균사를 캡슐화하는 데 사용될 수 있습니다. 동적 세포벽 장벽 (즉, 유두와 완전히 둘러싸인 haustorium)의 생산은 식물 저항을 촉진시키는 데 중요합니다3. 곰팡이 관련 질환에 대한 조직병리학적 연구는 이러한 메카니즘의 발생을 조사하였고, 진균 공격에 대한 내성 메카니즘으로서 세포벽 중합체, 셀룰로스, 헤미셀룰로오스(arabinoxylans) 및 칼로스를기술하였다 4,5,6,7.

세포벽은 미생물 공격에 대한 첫 번째 장벽으로, 식물과 곰팡이 상호 작용을 손상시킵니다. 펙틱 다당류는 세포벽을 구성하며 호모갈락투로난이 가장 풍부한 폴리머인 유디코트 식물의 일차 세포에서 세포벽 조성물의 약 30%를 차지한다(대략 60%)8. 골지는 갈락투론산 사슬을 포함하는 복합 펙틴 화합물을 분비하며, 이는메틸화 8,9일 수도 있고 아닐 수도 있다. 2012 이후, 문헌은 펙틴 메틸 에스테르 화의 정도가 미생물 펙틱 효소10,11,12에 의한 감염시 상용성을 결정하는 데 중요하다고 지적했다. 따라서, 식물-진균 병리계에서 펙틱 화합물의 존재 및 분포를 검증하기 위한 프로토콜이 요구된다.

유두나 하우스토리아의 캡슐화를 검출하기 위해 다양한 기술들이 사용되어 왔다. 사용 된 참조 방법은 고정 조직의 투과 전자 현미경 (TEM)과 살아있는 및 고정 조직의 광 현미경입니다. TEM과 관련하여, 몇몇 연구는 곰팡이 저항성 13,14,15,16에서 세포벽 임명의 구조적 역할을 입증했으며, 렉틴과 항체의 사용은 탄수화물 중합체16을 위치시키는 복잡한 방법이라는 것을 입증했다. 그러나 연구에 따르면 광 현미경 검사는 중요한 접근법이며 조직 화학 및 면역 조직 화학 도구는 유두와 haustorium encasement 6,7의 구성을 더 잘 이해할 수 있습니다.

병원성 곰팡이는 두 가지 주요 유형의 생활 방식을 보여줍니다 : 생물 영양 및 괴사. 생물 영양 진균은 영양을 위해 살아있는 세포에 의존하는 반면, 괴사 성 곰팡이는 숙주 세포를 죽인 다음 죽은 조직에 산다17. 라틴 아메리카에서는 곰팡이 헤밀리아 vastatrix에 의해 야기 된 커피 잎 녹이 커피 작물에서 중요한 질병입니다18,19. 헤밀리아 바스타트릭스는 생물영양 거동을 나타내고, 내성 커피 종 또는 품종에서 관찰된 구조적 변화 중에서도, 과민성 반응, 세포벽 상에 칼로스, 셀룰로스 및 리그닌의 침착, 뿐만 아니라 세포 비대(14)가 보고되었다. 저자의 지식에 따르면, 문헌은 커피 녹 저항에서 펙틴의 중요성에 대한 정보를보고하지 않습니다. 한편, 자궁경부정맥증을 유발하는 괴사성 진균은 펙티나제 및 폴리갈락투로나제20과 같은 세포벽 분해와 관련된 일련의 효소를 통해 펙틴을 표적으로 한다. 곰팡이 Cercospora coffeicola에 의해 야기 된 커피의 Cercosporiosis는 또한 커피 작물21,22에 대한 주요 위협입니다. 이 곰팡이는 잎과 열매 모두에서 괴사 성 병변을 일으 킵니다. 침투 후, C. coffeicola는 세포 내 및 세포 간 경로23,24,25를 통해 식물 조직을 식민지화합니다.

본 프로토콜은 세포벽에 곰팡이 구조 및 펙틴의 존재를 조사한다. 이 프로토콜은 곰팡이와의 생체 영양 상호 작용에서 숙주에 의해 유도되는 펙틴 (펙틴의 폴리 우론 산의 산성 그룹에 특이적인 루테늄 레드 염료로 염색)과 관련된 식물 반응을 확인하는 데 유용합니다. 또한 괴사 성 곰팡이가 펙트 세포벽의 분해에 미치는 영향을 확인하는 데 도움이됩니다. 본 결과는 이중 염색 방법이 곰팡이의 구조와 생식 단계를 구별하는 데 효과적이라는 것을 나타냅니다.

Protocol

1. 완충용액 및 시약의 제조 증류수 100 mL에 카코딜레이트 나트륨 4.28 g을 첨가하여 2 M 카코딜레이트 완충액을 제조하고 0.2 N HCl로 pH를 7.25로 조정하였다. 100 mL의 25% 수성 글루타르알데히드, 10% 수성 포름알데히드 10 mL, 25 mL의 2 M 카코딜레이트 완충액, 및 0.5 mL의 0.5 MCaCl2 26을 혼합하여 카르노프스키 고정제 용액 100 mL를 제조하였다. 증류수로 부?…

Representative Results

GMA 임베디드 섹션의 코튼 블루 락토페놀 염색은 생영양 및 괴사성 진균 상호작용 모두에서 커피 메소필 세포 사이와 내부 사이에 여러 곰팡이 구조의 존재를 밝혀냈다. 생물영양 병리계에서, 이중 염색 방법을 사용하여 염색할 때, 세포벽 및 치밀한 원형질체 함량을 함유하는 헤밀리아 vastatrix hyphae는 해면질과 팰리세이드 실질종 모두에서 진한 파란색으로 나타난다(<st…

Discussion

본 연구는 생물영양 병리계에서 하우스토리아를 캡슐화하는 세포벽의 펙틴 조성을 조사하기 위해 대안적인 이중 염색 조직화학 시험을 도입한다. 그 목적은 또한 그것에 의해 유도된 괴사성 균류 및 세포벽 변화를 검출하는 방법의 효능을 입증하는 것이다. 여기서, 커피 실질마 세포벽의 펙틴은 녹균인 헤밀리아 혈관염의 목과 하우스토리움을 모두 캡슐화할 수 있다. 실바 등은 또한 커피-…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자들은 허드슨 W. P. 드 카르발호 박사에게 이 작품을 개발하기 위한 지원에 감사를 표하고 싶다. 저자들은 또한 광 현미경 검사 시설을 제공 한 전자 현미경 연구소 ”엘리엇 와타나베 키타 지마 교수”에 감사드립니다. 저자들은 식물 재료에 병변을 공급해 준 Flávia Rodrigues Alves Patrício 박사에게 감사드립니다.

Materials

Blades DB80 HS Leica 14035838383 Sectioning
Cacodylate buffer EMS # 11652 Fixation
Cotton Blue Lactophenol Metaquímica 70SOLSIG024629 Staining
Formaldehyde EMS #15712 Fixation
Glutaraldehyde EMS #16216 Fixation
Historesin Kit Technovit /EMS #14653 Historesin for embedding
Hot plate Dubesser SSCD25X30-110V Staining
Microscopy Zeiss #490040-0030-000 Image capture
Microtome (Leica RM 2540) Leica 149BIO000C1 14050238005 Sectioning
Plastic molding cup tray EMS 10176-30 Staining
Ruthenium red LABHouse #006004 Staining
Software Axion Vision Zeiss #410130-0909-000 Image capture
Vaccum pump Prismatec 131 TIPO 2 V.C. Fixation
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Citer Cet Article
Marques, J. P. R., Nuevo, L. G. Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction. J. Vis. Exp. (180), e63432, doi:10.3791/63432 (2022).
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