Usamos técnicas padrão de resposta ao tronco cerebral (ABR) e aplicamos-as a galinhas filhotes, um modelo aviário precoce para função auditiva. O protocolo descreve detalhadamente as técnicas de preparação animal e aquisição da ABR, com etapas que podem se traduzir em outros modelos aviários ou roedores.
A resposta auditiva do tronco cerebral (ABR) é um ensaio inestimável em audiologia clínica, animais não humanos e pesquisa humana. Apesar do uso generalizado de ABRs na medição da sincronia neural auditiva e na estimativa da sensibilidade auditiva em outros sistemas de modelos vertebrados, os métodos para o registro de ABRs no frango não foram relatados há quase quatro décadas. As galinhas fornecem um modelo robusto de pesquisa animal porque seu sistema auditivo está perto da maturação funcional durante estágios embrionários tardios e precoces de incubação. Demonstramos métodos usados para obter gravações de ABR de um ou dois canais usando matrizes de eletrodos de agulha subdérmica em filhotes de frango. Independentemente da configuração de gravação de eletrodo (ou seja, montagem), as gravações de ABR incluíram formas de onda de pico positivas de 3-4 nos primeiros 6 ms de um estímulo de clique suprathreshold. As amplitudes de forma de onda de pico para cocho variaram de 2-11 μV em níveis de alta intensidade, com picos positivos exibindo funções esperadas de intensidade de latência (ou seja, aumento da latência em função da diminuição da intensidade). A posição padronizada do fone de ouvido foi fundamental para gravações ideais, pois a pele solta pode ocluir o canal auditivo, e o movimento animal pode desalojar o transdutor de estímulo. As amplitudes de pico foram menores, e as latências foram mais longas à medida que a temperatura do corpo animal diminuiu, apoiando a necessidade de manter a temperatura fisiológica do corpo. Para filhotes jovens (<3 h pós-hatch dia 1), os limiares foram elevados em ~5 dB, as latências máximas aumentaram ~1-2 ms, e o pico para amplitudes de cocho foram diminuídos ~1 μV em comparação com os filhotes mais antigos. Isso sugere um problema potencial de condução (ou seja, fluido na cavidade do ouvido médio) e deve ser considerado para filhotes jovens. No geral, os métodos ABR aqui descritos permitem o registro preciso e reprodutível da função auditiva in vivo em filhotes de frango que poderiam ser aplicados a diferentes estágios de desenvolvimento. Tais achados são facilmente comparados com modelos humanos e mamíferos de perda auditiva, envelhecimento ou outras manipulações relacionadas ao auditivo.
O estudo das respostas neurais evocadas a estímulos sonoros data de mais de meio século1. A resposta auditiva do tronco cerebral (ABR) é um potencial evocado que tem sido utilizado como uma medida de função auditiva tanto em animais não humanos quanto em humanos há décadas. A ABR humana apresenta cinco a sete picos de forma de onda convencionalmente rotulados por algarismos romanos (I-VII)2. Esses picos são analisados com base em sua latência (tempo de ocorrência em milissegundos) e amplitude (tamanho de pico para cocho em microvolts) das respostas neurais. A ABR é fundamental na avaliação da função e integridade do nervo auditivo, bem como da sensibilidade do tronco cerebral e do limiar auditivo. Os déficits no sistema auditivo resultam em latências e amplitudes ABR ausentes, reduzidas, prolongadas ou anormais. Notavelmente, esses parâmetros são quase idênticos em humanos e outros animais, tornando-se um teste objetivo consistente de função auditiva entre os modelosvertebrados 3.
Um desses modelos é o frango, e é especialmente útil por uma variedade de razões. As aves podem ser classificadas como altricial ou pré-ciais4. As aves altricial eclodem com sentidos ainda em desenvolvimento; por exemplo, corujas-do-celeiro não mostram uma ABR consistente até quatro dias após o hatch5. Animais precoces como a escotilha de frango com sentidos quase maduros. O início da audição ocorre no desenvolvimento embrionário, de tal forma que dias antes do hatch (dia 21), o sistema auditivo está próximo da maturação funcional 6,7,8. As aves altricial e a maioria dos modelos de mamíferos são suscetíveis a fatores extrínsecos que influenciam o desenvolvimento e requerem criação animal até que a audição esteja madura. Os ABRs de frango podem ser realizados no mesmo dia que a escotilha, esquecendo a necessidade de alimentação ou um ambiente enriquecido.
O frango embrionário tem sido um modelo bem estudado para fisiologia e desenvolvimento, especialmente no tronco cerebral auditivo. Estruturas específicas incluem o núcleo coclear de frango, dividido em núcleo magnocelularis (NM) e núcleo angularis (NA), e o correlato aviário da azeitona superior medial conhecida como núcleo laminaris (NL)6,7. A ABR é ideal para focar na função auditiva central antes do nível do cérebro e do córtex. A tradução entre medições in vivo ABR e estudos neuronais in vitro de desenvolvimento8, fisiologia9, tonotopia10 e genética11,12 fornece oportunidades ideais de pesquisa que apoiam estudos da função auditiva global.
Embora a ABR tenha sido extensivamente estudada em modelos mamíferos, tem havido menos foco para os aviários. Estudos anteriores da ABR aviária incluem caracterizações do budgerigar13, pica-pau14, gaivota15, aves de mergulho16, zebra finch17, raptores diurnos18, canário19, três espécies de coruja 5,20,21,22 e frango23. Dadas as quase quatro décadas desde a última caracterização completa do frango ABR, muitos dos equipamentos e técnicas anteriormente utilizados mudaram. Insights de estudos em outros modelos aviários podem ajudar a desenvolver a metodologia moderna de ABR de frango, ao mesmo tempo em que servem como comparação com o frango ABR. Este artigo delineará a configuração e o design experimentais para permitir a gravação de ABR em galinhas filhotes que também poderiam ser aplicadas a estágios embrionários de desenvolvimento e outros pequenos modelos de roedores e aviários. Além disso, dado o desenvolvimento precoce do frango, as manipulações de desenvolvimento podem ser realizadas sem qualquer pecuária extensiva. As manipulações para um embrião em desenvolvimento podem ser avaliadas apenas algumas horas após o animal chocar com capacidade auditiva quase madura.
O tronco cerebral auditivo das aves é bem estudado, e muitas estruturas são análogas à via auditiva dos mamíferos. O nervo auditivo fornece insumos excitatórios nos dois núcleos centrais de primeira ordem, o núcleo coclear magnocelularis (NM) e angularis (NA). NM envia uma projeção excitatória bilateralmente para seu alvo auditivo, núcleo laminaris (NL)7. NL projeta para o núcleo mesencephalicus lateralis, pars dorsalis (MLd)40,41. A NL também projeta para o núcleo olivary superior (SON), que fornece inibição de feedback para NM, NA e NL42. Este microcircuito cerebral auditivo inferior é requintadamente conservado para a função que ele subserve, localização sonora e audição binaural33. As regiões superiores auditivas da ave também têm núcleos análogos ao lemniscus lateral mamífero e colículo inferior no cérebro médio. Dadas essas semelhanças, a composição da ABR aviária até o cérebro médio auditivo é comparável entre todos os vertebrados.
Enquanto várias espécies aviárias apresentam três picos positivos dentro de 6 ms após o início do estímulo, a correlação dos picos de ABR com as estruturas auditivas centrais tem alguma variabilidade. Onda Eu posso ser razoavelmente assumido como a primeira resposta neural da papila basílica periférica e nervo auditivo e apresenta pouca variabilidade entre os indivíduos (Figura 1C). A identificação subsequente da onda é menos certa e pode diferir entre espécies. Kuokkanen et al.17 determinaram recentemente que a Onda III da ABR da coruja-do-celeiro é gerada pela NL; assim, é razoável argumentar que a Onda II se origina da NM e na NA do núcleo coclear20. No entanto, a onda iii coruja foi definida como o pico positivo gerado 3 ms após o início do estímulo. Isso corresponde à Onda II como definido no frango de incubação ABR. Na coruja-do-celeiro ABR, as ondas I e II foram combinadas.
Enquanto o frango filhote geralmente apresentava três picos dentro de 6 ms, um quarto pico era ocasionalmente observado (por exemplo, ver Figura 1A). Dados populacionais, tamanho amostral maior e paradigmas experimentais adicionais seriam necessários para apoiar uma quarta onda e, em alguns casos, um frango de cinco ondas ABR. O achado mais consistente foram as três representações de pico mostradas aqui.
Uma vez que a ABR é definida como uma medida de sincronia neural, os principais núcleos na via auditiva poderiam representar cada pico positivo na ABR. O sinal que passa do nervo auditivo para NM/NA e, em seguida, para NL pode definir ondas I, II e III no frango de incubação ABR, respectivamente. Além disso, o quarto pico posterior do frango ABR poderia representar uma estrutura auditiva superior ou midbrain. A caracterização das ABRs aviárias também deve considerar a diferença entre aves pré-comerciais e altriciais. O amadurecimento das respostas auditivas variará entre as espécies e também é afetado por outros traços críticos, como comportamento predador e/ou aprendizagem vocal4. Independentemente disso, os métodos e técnicas descritos são facilmente aplicados a uma variedade de espécies aviárias e vertebradas.
A importância da manutenção da temperatura corporal animal é ilustrada na Figura 2. À medida que a temperatura interna do corpo diminuiu, a latência das respostas da ABR aumentou para o mesmo nível de intensidade de estímulo. Isso é mais pronunciado quando a temperatura corporal cai abaixo de 32 °C36,37. O aumento de latência de aproximadamente 1 ms na ABR é menor do que o relatado anteriormente no frango23. No entanto, Katayama23 usou um filhote de 12 dias de idade que foi resfriado e posteriormente aquecido durante um período de 4 horas. Os dados da Figura 2 foram registrados durante o processo de resfriamento durante um período de 20 minutos. Para adquirir a melhor qualidade e as gravações mais consistentes, a temperatura corporal do animal deve ser mantida, e todas as gravações devem ser feitas na mesma temperatura fisiológica entre os animais.
O efeito da idade na ABR é leve, mas importante a considerar. Embora apenas a latência das Ondas I e II da ABR tenha sido significativamente diferente, isso ocorre em parte porque apenas três filhotes jovens foram usados na Figura 3; os outros três não apresentaram três picos ABR identificáveis. A amplitude e as mudanças de limiar da ABR também podem ser evidentes se usar grandes tamanhos de amostra ou comparar ABRs específicos da frequência. Este efeito relacionado à idade pode ser causado por fluido no ouvido médio do frango. Tais mudanças condutivas levam a um aumento acentuado dos limiares de ABR para os modelos humanos e outros mamíferos38,39.
Utilizando duas montagens de gravação diferentes, foram observadas respostas semelhantes (Figura 4A). Enquanto a montagem mais comum coloca o eletrodo de referência atrás do ouvido receptor de estímulo, ter o eletrodo de referência no tecido do pescoço pode ser útil se houver intervenção cirúrgica que acompanha a ABR. No entanto, se forem utilizadas gravações ABR de dois canais, os eletrodos de referência devem ser colocados separadamente e simetricamente, o que é difícil se colocar o eletrodo de referência no pescoço. Recomenda-se que a posição mastoide para o eletrodo de referência padronize o maior número possível de aspectos de gravação. A gravação de ABR de dois canais é uma ferramenta eficaz que requer pouca preparação extra e resulta em respostas semelhantes entre os ouvidos. Pequenas diferenças de amplitude foram prováveis devido ao posicionamento do fone de ouvido. A gravação de dois canais permite uma comparação fácil entre um hemisfério cerebral ou de ouvido experimentalmente manipulado versus um controle. Essa configuração também seria necessária para testar ABRs binaurais. Experimentos futuros usando o frango ABR podem se referir à literatura anterior sobre configurações de gravação e montagens34.
Essa metodologia vem com várias limitações. Como mencionado na etapa 5.1, a má colocação do espéculo pode levar a uma mudança de 40 dBSPL em resposta. Isso pode causar uma interpretação incorreta de um animal manipulado ou modificado. Recomenda-se as seguintes precauções: adquirir uma grande amostra de dados de controle antes de adquirir os ABRs de modelos manipulados ou mutantes. Não diminua a intensidade de estímulo em mais de 20 dBSPL entre gravações. Se a amplitude ou latência mudar mais do que o esperado, verifique a posição animal e espéculo. Repita esse estímulo ABR para observar as alterações. Se o espéculo se moveu, readquive testes anteriores. Outra limitação é a calibração das ABRs. Sem a calibração adequada para registrar o nível de pressão sonora, a intensidade apresentada ao animal é desconhecida. Ao medir a saída de som, use o mesmo espéculo que na gravação experimental e um pequeno microfone dentro de uma cavidade que se aproxima do comprimento do canal auditivo do animal (~5 mm). Meça as mesmas frequências de tom utilizadas em experimentos, pois as calibrações são específicas de frequência. O manual para sistemas de hardware e software pode vir com instruções para calibração. Há também filtros adicionais, como fase linear e filtros de fase mínima, que podem melhorar o clique e o tom estourar ABRs43. Estes filtros não foram utilizados no presente estudo. Considerações adicionais, como o tempo de ascensão e queda de um toque de estouro de envelope espectral mudando em função da frequência ou alterando o tempo de ascensão e queda dos estímulos do clique também não foram examinadas. Estas são boas investigações futuras, uma vez que ABRs confiáveis e consistentes podem ser adquiridas.
A comparação do frango filhote com outros modelos aviários é promissora. Budgerigars e corujas orientais também apresentam três picos positivos de microvolt dentro dos primeiros 6 ms da ABR13,22. Em diferentes espécies de pica-paus, três picos também são vistos, mas sua latência é mais tarde no tempo. Além disso, a faixa de melhor sensibilidade de frequência em pica-paus está entre 1500 e 4000 Hz, o que é um pouco maior do que o melhor limiar do frango em 1000 Hz. No frango adulto, a melhor sensibilidade está em 2000 Hz35, então pode haver melhor audição de altas frequências à medida que os filhotes de frango se desenvolvem em adultos. Esse desenvolvimento será diferente entre as espécies de aves, levando em conta o desenvolvimento altricial ou precoce do animal4.
Os métodos experimentais aqui descritos podem ajudar a determinar quais fatores levam a prejuízos ou mudanças nas respostas e limiares auditivos, bem como estudos em diferentes estágios de desenvolvimento embrionário. Manipulação genética, envelhecimento e exposição ao ruído são manipulações conhecidas em animais e outros modelos aviários 24,25,44,45. Esses métodos devem ser estendidos ao modelo de frango agora que técnicas como a eletroporação in-ovo permitem a expressão de proteínas que são controladas focalmente e temporalmente em um lado do tronco cerebral auditivo12,46. Isso permite a comparação direta das ABRs do ouvido geneticamente manipulado ao ouvido de controle contralateral usando um paradigma de gravação de dois canais.
No geral, a ABR de galinhas filhotes é um método de pesquisa útil, quase idêntico às medidas de função auditiva em modelos humanos e outros mamíferos. É também uma metodologia não invasiva e invasiva . Além da injeção anestésica e colocação de eletrodos subdérmicos de alguns milímetros, nenhuma outra manipulação física é necessária. Um filhote poderia teoricamente ser testado várias vezes durante um curso de tempo de desenvolvimento de dias ou semanas se mantido em um ambiente apropriado. Este protocolo não apenas estabelece as etapas necessárias e os parâmetros de registro para o frango incubador ABR, mas propõe características de uma ABR aviária que pode informar mais testes na função de tronco cerebral auditivo.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho é suportado pelo NIH/NIDCD R01 DC017167
1/8 inch B&K Microphone | Brüel & Kjær | 4138 | Type 4138-A-015 also works |
Auditory Evoked Potential Universal Smart Box | Intelligent Hearing Systems | M011110 | |
Custom Sound Isolation Chamber | GK Soundbooth Inc | N/A | Custom built |
DC Power Supply | CSI/Speco | PSV-5 | |
ER3 Insert Earphone | Intelligent Hearing Systems | M015302 | Used as sound transducer |
Euthasol | Virbac | 710101 | Controlled Substance; euthanasia solution |
Insulin Syringe (29 G) | Comfort Point | 26028 | |
Ketamine | Covetrus | 11695-0703-1 | Controlled Substance |
Power Supply | Powervar | 93051-55R | |
Rectal Probe | YSI | 401 (10-09010) | Any 400 series probe will work with the YSI temperatuer monitor |
Subdermal needles | Rhythmlink | RLSND107-1.5 | |
Temperature Monitor | YSI | 73ATA 7651 | Works with any 400 series rectal probe |
Xylazine | Anased | 59399-110-20 | Used with ketamine and water for anesthetic |