Cultivos primarios de astrocitos de rata y microglia y su uso en el estudio de la esclerosis lateral amiotrófica

Summary

Presentamos aquí un protocolo sobre cómo preparar cultivos primarios de células gliales, astrocitos y microglía de cortezas de rata para imágenes de video de lapso de tiempo de Ca²⁺ intracelular para la investigación sobre fisiopatología de la esclerosis lateral amiotrófica en el modelo de rata hSOD1^G93A .

Abstract

Este protocolo demuestra cómo preparar cultivos primarios de células gliales, astrocitos y microglía de las cortezas de ratas Sprague Dawley y cómo usar estas células con el fin de estudiar la fisiopatología de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) en el modelo hSOD1^G93A de rata. Primero, el protocolo muestra cómo aislar y cultivar astrocitos y microglia de cortezas de ratas postnatales, y luego cómo caracterizar y probar la pureza de estos cultivos mediante inmunocitoquímica utilizando el marcador de proteína ácida fibrilar glial (GFAP) de los astrocitos y el marcador microglial ionizado de la molécula adaptadora de unión al calcio 1 (Iba1). En la siguiente etapa, se describen métodos para la carga de colorantes (Fluo 4-AM sensible al calcio) de células cultivadas y las grabaciones de cambios de Ca²⁺ en experimentos de imágenes de video en células vivas.

Los ejemplos de grabaciones de vídeo consisten en: (1) casos de imágenes de Ca²⁺ de astrocitos cultivados expuestos agudamente a inmunoglobulina G (IgG) aislados de pacientes con ELA, mostrando una respuesta característica y específica en comparación con la respuesta al ATP como se demostró en el mismo experimento. Los ejemplos también muestran un aumento transitorio más pronunciado en la concentración de calcio intracelular evocado por ALS IgG en astrocitos hSOD1^G93A en comparación con los controles no transgénicos; (2) imágenes de Ca 2+ de astrocitos cultivados durante una depleción de las reservas de calcio por thapsigargin (Thg), un inhibidor no competitivo de la ATPasa del retículo endoplásmico Ca 2+, seguida de una entrada de calcio operada por el almacén provocada por la adición de calcio en la solución de registro, lo que demuestra la diferencia entre la operación de almacenamiento de Ca²⁺ en hSOD1^G93A y en astrocitos no transgénicos; (3) Las imágenes de Ca 2+ de la microglía cultivada muestran predominantemente una falta de respuesta a la IgG de ELA, mientras que la aplicación de ATP provocó un cambio de Ca²⁺. Este documento también enfatiza posibles advertencias y precauciones con respecto a la densidad celular crítica y la pureza de los cultivos, eligiendo la concentración correcta del colorante Ca²⁺ y las técnicas de carga de colorante.

Introduction

Las técnicas de cultivo celular han dado lugar a numerosos avances en diversos campos de la neurofisiología celular en la salud y la enfermedad. En particular, los cultivos celulares primarios, recién aislados del tejido neuronal de un animal de laboratorio, permiten al experimentador estudiar de cerca el comportamiento de diversas células en diferentes medios bioquímicos y configuraciones fisiológicas. El uso de diferentes indicadores fisiológicos fluorescentes, como los colorantes sensibles al Ca²⁺ en combinación con la microscopía de video de lapso de tiempo, proporciona una mejor comprensión de los procesos biofísicos y bioquímicos celulares en tiempo real.

La ELA es una enfermedad neurodegenerativa devastadora que afecta a las neuronas motoras superiores e inferiores¹. La enfermedad tiene una patogénesis compleja de tipo familiar, pero principalmente de forma esporádica (90% de los casos)². Es bien sabido que los mecanismos autónomos no celulares contribuyen a la fisiopatología de la ELA, principalmente debido al papel esencial de las células gliales³. La ELA también se caracteriza bien como una enfermedad neuroinflamatoria con la participación de factores humorales y celulares de inflamación.

La inmunoglobulina G es ampliamente utilizada como marcador molecular en la ELA y otras enfermedades neurodegenerativas. El estudio del nivel sérico de este marcador puede indicar la presencia y el estadio de la neuroinflamación en la enfermedad ^4,5,6, mientras que su presencia en el líquido cefalorraquídeo puede indicar una ruptura de la barrera hematoencefálica⁷. Las IgG también fueron identificadas como depósitos en las neuronas motoras de la médula espinal de pacientes con ELA⁷. Sin embargo, este abordaje ha mostrado algunas inconsistencias en la correlación del nivel de IgG con el estadio y las características de la enfermedad⁶.

La IgG aislada de sueros de pacientes con ELA (ALS IgG) puede inducir una respuesta al calcio en^{astrocitos 8} naïve y la liberación de glutamato en las neuronas, apuntando a un efecto excitotóxico, un sello distintivo de la patología de ELA⁹. Sin embargo, los estudios en el modelo de rata hSOD1^G93A ALS (que contiene múltiples copias de la mutación SOD1 humana¹⁰) mostraron una serie de marcadores de estrés oxidativo en células neurogliales cultivadas 11, tejidos 12,13,14 o animales vivos ¹³. Cabe destacar que los astrocitos cultivados del modelo de rata ALS fueron más propensos al estrés oxidativo inducido por el peróxido que la astroglía de compañeros de camada no transgénicos¹¹.

Las células microgliales en cultivo se ven afectadas por la ELA IgG de una manera menos aparente. A saber, una línea celular microglial BV-2 mostró un aumento en la señal de marcadores fluorescentes de estrés oxidativo en respuesta a la aplicación de solo 4/11 muestras de pacientes con ELA^{IgG 15}. Es bien sabido que la microglía participa en muchas patologías neuroinflamatorias, añadiendo estrés oxidativo y fase de progresión tardía en el mecanismo autónomo no celular de ALS^16,17. Sin embargo, los datos con ALS IgG indicaron que estas células pueden no ser tan reactivas como los astrocitos a estos factores humorales de la inflamación de la ELA. Se han realizado varios estudios con astrocitos primarios de modelos murinos de ELA, no solo en cachorros sino también en animales sintomáticos, ya sea en el cerebro o en la médula espinal 18,19,20,21. Esto también es cierto para los cultivos primarios microgliales, aunque en menor medida que los astrocitos y principalmente de regiones cerebrales en la etapa embrionaria^22,23,24.

Utilizamos imágenes de video de lapso de tiempo de Ca²⁺ en células en cultivo principalmente como un medio para seguir los transitorios intracelulares de este ion como un marcador fisiológico de excitotoxicidad. Así, mediante la caracterización biofísica de estos transitorios (amplitud, área bajo transitorio, tiempo de subida, frecuencia) el investigador puede obtener parámetros diagnósticos experimentales a partir de diversos modelos celulares de neurodegeneración. Por lo tanto, esta técnica ofrece una ventaja de una evaluación fisiológica cuantitativa de IgG como biomarcadores de enfermedades. Existe una gran cantidad de literatura sobre el papel de las IgG y el Ca²⁺ en la inducción de la ELA. La mayoría de estos estudios se realizaron mediante la inducción de ELA mediante la inyección de IgG de pacientes en animales de experimentación 25,26,27,28,29^, que luego mostraron elevación intracelular de Ca ²⁺ y depósitos de IgG. Una línea de estudios exploró el efecto de las IgG de ELA en la sinapsis motora in vitro^30,31,32. En el contexto anterior, la técnica presentada aquí pone el foco en las células gliales como actores importantes en el mecanismo autónomo no celular de la ELA y cuantifica su potencial respuesta excitotóxica a las IgG como factores humorales de neuroinflamación. Este enfoque puede tener una aplicación más amplia en la prueba de otros factores humorales como sueros enteros, LCR o citoquinas en diferentes sistemas de cultivo celular y en modelos celulares de inflamación general.

Este documento describe cómo preparar cultivos primarios de células gliales, astrocitos y microglía de las cortezas de ratas Sprague Dawley y cómo usar aún más estas células para estudiar la fisiopatología de la ELA con IgG derivada de sueros del paciente. Los protocolos se detallan para la carga de colorante de células cultivadas (Figura 1) y las grabaciones de cambios de Ca²⁺ en experimentos de imágenes de video de lapso de tiempo. Ejemplos de grabaciones de video mostrarán cómo reaccionan las células gliales a la IgG ALS en comparación con el ATP, este último activando los receptores de membrana purinérgica. Se muestra por primera vez un ejemplo de cómo los astrocitos aislados del cerebro de rata hSOD1^G93A ALS reaccionan con una respuesta de Ca 2+ más pronunciada a la IgG de ELA en comparación con los controles no transgénicos y cómo relacionar este proceso con las diferencias en la operación de almacenamiento de Ca²⁺. También se muestra un ejemplo de imágenes de calcio en células microgliales con un desafío agudo con ELA IgG, con solo una respuesta modesta de calcio intracelular.

Protocol

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directivas de la UE sobre la protección de los animales con fines científicos y con el permiso de la Comisión de Ética de la Facultad de Biología de la Universidad de Belgrado (número de aprobación EK-BF-2016/08). En cuanto al material del paciente (sueros para IgGs), se recolectó para el examen clínico de rutina con el consentimiento informado del paciente de acuerdo con el Código de Ética de la Asociación Médica Mundial (Declaración de Helsinki) para…

Representative Results

Caracterización de diferentes tipos de células gliales en cultivoPor lo general, toma de 15 a 21 días producir astrocitos para experimentos, mientras que las células microgliales tardan de 10 a 15 días en crecer. Se realizó inmunotinción para evaluar la pureza celular del cultivo. La Figura 1 muestra la expresión del doble marcaje del marcador astrocítico GFAP y el marcador microglial Iba1 en cultivos respectivos. Se sabe que las imá…

Discussion

Este artículo presenta el método de cultivo de células primarias como una herramienta rápida y “dentro del presupuesto” para estudiar diferentes aspectos de la (fisio)fisiología celular, como la ELA en el modelo hSOD1^G93A de rata. Por lo tanto, la técnica es adecuada para estudios a nivel unicelular que pueden extrapolarse e investigarse más a fondo a un nivel superior de organización (es decir, en rodajas de tejido o en un animal vivo). El cultivo celular como técnica, sin embargo, tiene algunas adve…

Materials

15 mL tube	Sarstedt, Germany	62 554 502
2 mL tube	Sarstedt, Germany	72.691
21 G needle	Nipro, Japan	HN-2138-ET
23 G needle	Nipro, Japan	HN-2338-ET
5 mL syringe	Nipro, Japan	SY3-5SC-EC
6 mm circular glass coverslip	Menzel Glasser, Germany	630-2113
60 mm Petri dish	ThermoFisher Sientific, USA	130181
ATP	Sigma-Aldrich, Germany	A9062
AxioObserver A1	Carl Zeiss, Germany
Bovine serum albumine	Sigma-Aldrich, Germany	B6917
Calcium chloride	Sigma-Aldrich, Germany	2110
Centrifuge	Eppendorf, Germany
DAPI	Sigma-Aldrich, Germany	10236276001
D-glucose	Sigma-Aldrich, Germany	158968
DMEM	Sigma-Aldrich, Germany	D5648
Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody	Invitrogen, USA	A-21447
Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody	Invitrogen, USA	A-21202
EDTA	Sigma-Aldrich, Germany	EDS-100G
EGTA	Sigma-Aldrich, Germany	E4378
”evolve”-EM 512 Digital Camera System	Photometrics, USA
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	10500064
Fiji ImageJ Software	Open source under the GNU General Public Licence
FITC filter set	Chroma Technology Inc., USA
Fluo-4 AM	Molecular Probes, USA	F14201
Goat anti-Iba1	Fujifilm Wako Chemicals, USA	011-27991
HEPES	Biowest, France	P5455
HighSpeed Solution Exchange System	ALA Scientific Instruments, USA
Incubator	Memmert GmbH + Co. KG, Germany
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich, Germany	M2393
Matlab software	Math Works, USA
Mouse anti-GFAP	Merck Millipore, USA	MAB360
Mowiol 40-88	Sigma-Aldrich, Germany	324590
Normal donkey serum	Sigma-Aldrich, Germany	D9663
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, Germany	158127
Penicilin and Streptomycin	ThermoFisher Sientific, USA	15140122
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich, Germany	P5899
Potassium chloride	Sigma-Aldrich, Germany	P5405
Potassium dihydrogen phosphate	Carlo Erba Reagents, Spain	471686
Shaker DELFIA PlateShake	PerkinElmer Life Sciencies, USA
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, Germany	S3817
Sodium chloride	Sigma-Aldrich, Germany	S5886
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Carl ROTH GmbH	X987.2
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich, Germany	P5280
Thapsigargine	Tocris Bioscience, UK	1138
Triton X – 100	Sigma-Aldrich, Germany	T8787
Trypsin	Sigma-Aldrich, Germany	T4799
Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520	Wescor, ELITechGroup Inc., USA
ViiFluor Imaging System	Visitron System Gmbh, Germany
VisiChrome Polychromator System	Visitron System Gmbh, Germany
VisiView high performance setup	Visitron System Gmbh, Germany
Xenon Short Arc lamp	Ushio, Japan