Administración subconjuntival de vectores de virus adenoasociados en modelos de animales pequeños
Summary
En este manuscrito, la inyección subconjuntival se demuestra como un método válido de administración de vectores para tejidos oculares en ratones utilizando un sistema de inyección que consiste en una bomba de jeringa de infusión/extracción y una jeringa extraíble hermética al gas acoplada con agujas de microinyección. Este sistema de inyección también es adaptable para otras vías de administración intraocular.
Abstract
Las enfermedades oculares incluyen una amplia gama de trastornos genéticos y adquiridos hereditarios que son objetivos atractivos para la administración local de fármacos debido a su relativa facilidad de acceso a través de múltiples vías de administración. Las inyecciones subconjuntivales (SCJ) ofrecen ventajas sobre otras vías de administración intraocular, ya que son simples, seguras y generalmente se realizan en un entorno ambulatorio. Las inyecciones de SCJ en animales pequeños generalmente requieren la asistencia de un microscopio quirúrgico debido al tamaño del ojo. Trabajos previos han demostrado que la inyección SCJ de serotipos específicos de virus adenoasociados (AAV) es una estrategia válida de administración de genes para la transducción dirigida de la superficie ocular, el músculo ocular, la córnea y el nervio óptico, proporcionando un enfoque potencial para el tratamiento de muchas enfermedades oculares.
En este documento, se presenta un protocolo detallado para las inyecciones de SCJ en un modelo de ratón utilizando un sistema de inyección que consiste en una bomba de jeringa de infusión/extracción programable (que permite una velocidad y presión de inyección consistentes y precisas) y una jeringa extraíble hermética al gas junto con agujas de microinyección. El sistema de inyección también es adaptable para otras vías de administración intraocular, como inyecciones intrastromales, intracamerales, intravítreas y subretinianas en animales pequeños. Aunque se describe la administración de vectores virales adenoasociados para estudios de terapia génica ocular, el protocolo aquí incluido también se puede adaptar para una variedad de soluciones oftálmicas en modelos de animales pequeños. Los pasos prácticos clave en la ruta de administración, la configuración de la plataforma de inyección, la preparación de la inyección y los consejos de la experiencia directa se discutirán en detalle. Además, también se discutirán brevemente las técnicas comunes de validación para la confirmación de la entrega de AAV a los tejidos deseados.
Introduction
Las enfermedades oculares abarcan una amplia gama de trastornos genéticos y adquiridos. En 2015, se estima que 36 millones de personas eran legalmente ciegas en todo el mundo, y más de 1.000 millones de personas sufren de al menos algún nivel de discapacidad visual, lo que destaca la necesidad de ampliar los esfuerzos de alivio en todos los niveles1. Los principales métodos para administrar medicamentos oculares incluyen la administración tópica y local, como gotas para los ojos o inyecciones subconjuntivales (SCJ), intracamerales, intravítreas y subretinianas. Aunque la terapia tópica no invasiva es el método de administración más común para los fármacos oftálmicos y se usa ampliamente para muchos trastornos del segmento anterior, la presencia de barreras anatómicas corneales presenta un desafío para la biodisponibilidad, biodistribución y eficacia de las sustancias administradas tópicamente, lo que sugiere que puede no ser la mejor ruta de tratamiento candidata para muchas enfermedades del ojo interno. Es probable que la inyección local en el compartimiento ocular específico afectado por la enfermedad sea un enfoque de administración de fármacos más eficaz y dirigido2. Sin embargo, los efectos adversos resultantes de las inyecciones repetidas pueden complicar las estrategias de administración. Idealmente, una terapia debe mantener la eficacia terapéutica a largo plazo después de una sola administración. Por lo tanto, la terapia génica es una opción prometedora para minimizar el número de inyecciones requeridas y proporcionar una expresión transgénica sostenida para el tratamiento de la enfermedad ocular 3,4.
Numerosos vectores virales y no virales están disponibles para la terapia génica; sin embargo, los vectores AAV son de gran interés debido a su excelente perfil de seguridad. AAV es un virus de ADN pequeño, monocatenario y sin envoltura que fue descubierto inicialmente como contaminante de una preparación de adenovirus en 1965 por Atchison et al.5,6 AAV fue posteriormente diseñado como un vector viral eficiente para la entrega de genes en la década de 1980 y se ha convertido en el vector de terapia génica de elección para muchas enfermedades, incluidos los trastornos oculares. en las últimas décadas. El más notable de ellos es el primer fármaco de terapia génica disponible comercialmente, voretigene neparvovec, que fue aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos para tratar la amaurosis congénita de Leber, una rara enfermedad ocular posterior. Aunque voretigene neparvovec ha superado con éxito las barreras para el desarrollo clínico, sigue habiendo desafíos para la comercialización de terapias génicas oculares adicionales. Por ejemplo, voretigene neparvovec se administra a pacientes que retienen células retinianas viables mediante inyección subretiniana. Por lo tanto, los pacientes con formas más avanzadas de la enfermedad que carecen de células retinianas viables no son elegibles para el tratamiento, ya que no proporcionaría ningún beneficio clínico. Además, se observaron complicaciones conocidas asociadas con el procedimiento de inyección subretiniana, incluyendo inflamación ocular, cataratas, lagrimeo retiniano, maculopatía y dolor 7,8. Otras preocupaciones relacionadas con este procedimiento incluyen la posibilidad de hemorragia, desprendimiento de retina, endoftalmitis y revocación del estado inmune privilegiado ocular a través de la destrucción del tejido ocular 9,10,11,12. Por lo tanto, los esfuerzos para explorar rutas de administración de genes menos invasivas, como la inyección de SCJ, se han vuelto cada vez más importantes 13,14,15,16,17.
La conjuntiva es una membrana delgada que contiene 3-5 capas de células y conecta el ojo anterior con el párpado interior. Las inyecciones de SCJ se utilizan clínicamente para la administración de fármacos oftálmicos a los segmentos anterior y/o posterior del ojo para el tratamiento de enfermedades oculares como la degeneración macular asociada a la edad, glaucoma, retinitis y uveítis posterior18,19. Son relativamente simples de realizar, empleados rutinariamente para la administración de fármacos oftálmicos en un entorno ambulatorio20, algo indoloros, no comprometen el privilegio inmune ocular y permiten que los fármacos administrados se propaguen a través de una gran región periorbitaria que abarca el nervio óptico. Por lo tanto, las inyecciones de SCJ son una vía de administración atractiva para las aplicaciones de terapia génica AAV. Los serotipos naturales de AAV administrados mediante inyección de SCJ en ratones han sido previamente caracterizados por su seguridad, eficiencia de transducción, inmunogenicidad sérica, biodistribución y especificidad tisular13,16,21. Estos datos demostraron que la administración de genes a tejidos oculares individuales a través de la administración de SCJ es una posibilidad formal.
Este documento describe un protocolo simple y adaptable para la inyección de SCJ para entregar vectores AAV en un modelo de ratón. Para garantizar la reproducibilidad de este enfoque, se describe un sistema de inyección que consiste en un estereomicroscopio, una bomba de jeringa de infusión/extracción programable (que permite una velocidad y presión de inyección consistentes y precisas) y una jeringa extraíble hermética al gas junto con agujas de microinyección. Este sistema es adaptable para otras vías de administración intraocular como inyecciones intraestromales, intracamerales, intravítreas y subretinianas en animales pequeños. Además, a menudo se utiliza un tinte fluoresceína para permitir la visualización del sitio de inyección de AAV. Los pasos prácticos clave en la ruta de administración, la configuración de la plataforma de inyección, la preparación de la inyección y los consejos de la experiencia directa se discutirán en detalle. Finalmente, se discutirán brevemente las técnicas de validación comunes para la confirmación de la administración de AAV a los tejidos deseados.
Protocol
Representative Results
Discussion
La terapia génica mediada por AAV tiene un gran potencial para el tratamiento de enfermedades oculares. La terapia génica ocular actual se basa en dos vías principales de administración local, inyecciones intravítreas y subretinianas. Desafortunadamente, ambas rutas son invasivas y pueden causar complicaciones graves, como desprendimiento de retina, formación de cataratas y endoftalmitis. Por lo tanto, la investigación de rutas relativamente menos invasivas, como la inyección de SCJ, es de gran interés.
<p c…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al Vector Core de la Universidad de Carolina del Norte por proporcionar los vectores scAAV8-GFP utilizados en este estudio, el CGIBD Histology Core y el laboratorio del Dr. Brian C. Gilger por su ayuda con los aspectos de evaluación clínica de este estudio. Este estudio fue apoyado por la Beca Postdoctoral Distinguida de Pfizer-NC Biotech y un Premio de Desarrollo Profesional de la Sociedad Americana de Terapia Génica y Celular y la Fundación de Fibrosis Quística. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de la Sociedad Americana de Terapia Génica y Celular o la Fundación de Fibrosis Quística.
Materials
| 36 G NanoFil Needles | World Precision Instruments | NF36BV-2 | |
| AAV vector | University of North Carolina at Chapel Hill | / | |
| Acepromazine | Henry Schein | NDC 11695-0079-8 | |
| anti-GFP antibody | AVES labs Inc. | ||
| Digital camera | Cannon | Cannon EOS T5i | |
| DNA/RNA extraction kit | Qiagen | 80204 | |
| Forceps | Fine Science Tools | F6521 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7654-01 | |
| India ink | StatLab | NC9903975 | |
| Ketamine hydrochloride injection solution | Henry Schein | NDC 0409-2051-05 | |
| Moisture-resistant film | Parafilm | 807-6 | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company | 427401 | |
| Proparacaine 0.1% | Bausch Health US | NDC 24208-730-06 | |
| Rebound tonometer | Tonovet | / | |
| Sodium fluorescein solution | Sigma-Aldich | 46960 | |
| Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Bioscience | 70-4504 | |
| Stereo microscopye | Leica | Mz6 | |
| Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5% | Bausch and Lomb | Rx only | |
| Topical ointment | GenTeal | NDC 0078-0429-47 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads | ZONE-QUICK | PO6448 |
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