Raman Boyaları ile Yüksek Oranda Çoklanmış Doku Görüntüleme
Summary
Gökkuşağı benzeri Raman boyalarının elektronik pre-rezonans uyarılmış Raman saçılması (epr-SRS) görüntülemesi, yüksek oranda çoklanmış epitop bazlı protein görüntüleme için yeni bir platformdur. Burada, antikor hazırlama, doku örneği boyama, SRS mikroskop montajı ve epr-SRS doku görüntülemeyi içeren pratik bir kılavuz sunuyoruz.
Abstract
Dokulardaki spesifik biyobelirteçlerin geniş bir kapsamını görselleştirmek, karmaşık biyolojik sistemlerin karmaşık organizasyonlarını keşfetmede hayati bir rol oynar. Bu nedenle, yüksek oranda çoklanmış görüntüleme teknolojileri giderek daha fazla takdir edilmektedir. Burada, gökkuşağı benzeri Raman boyalarının elektronik pre-rezonans uyarılmış Raman saçılması (epr-SRS) görüntülemesi yoluyla standart immünofloresansla karşılaştırılabilir duyarlılığa sahip spesifik proteinlerin yüksek oranda çoklanmış titreşimsel görüntülemesinin ortaya çıkan bir platformunu tanımlamaktayız. Bu yöntem, geleneksel immünofloresansta spektral olarak çözülebilir kanalların sınırını aşar ve hücre altı çözünürlüğe sahip dokulardaki çoklu belirteçleri sorgulamak için tek atışlık bir optik yaklaşım sağlar. Genellikle paraformaldehit ile sabitlenmiş dokular, dondurulmuş dokular ve formalin sabit parafin gömülü (FFPE) insan dokuları dahil olmak üzere standart doku preparatları ile uyumludur. Bu platformun, özellikle kalın bozulmamış dokular için biyolojik örneklerin protein etkileşimlerinin daha kapsamlı bir resmini sağlayacağını öngörüyoruz. Bu protokol, antikor hazırlamadan doku örneği boyamaya, SRS mikroskop montajına, epr-SRS doku görüntülemeye kadar iş akışını sağlar.
Introduction
Kompleks doku sistemleri, mekansal konumları ve etkileşim ağları işlevleri ve işlev bozuklukları ile derinden iç içe geçmiş farklı hücresel alt popülasyonlardan oluşur 1,2. Doku mimarisini ortaya çıkarmak ve karmaşıklığını sorgulamak için, proteinlerin tek hücre çözünürlüğündeki uzamsal konumlarının bilgisi esastır. Bu nedenle, yüksek oranda çoklanmış protein görüntüleme teknolojileri giderek daha fazla takdir edilmektedir ve doku biyolojisi 3,4,5’i incelemek için bir köşe taşı haline gelebilir. Günümüzde yaygın olarak kullanılan çoklanmış protein görüntüleme yöntemleri iki ana kategoriye ayrılabilir. Bunlardan biri, çoklu doku boyama ve görüntüleme turlarına dayanan seri immünofloresan görüntüleme, diğeri ise ağır metal etiketli antikorlar 6,7,8,9,10,11,12 ile birleştirilmiş görüntüleme kütle sitometrisidir.
Burada, multipleks antikor bazlı protein görüntüleme için alternatif bir strateji tanıtılmıştır. Geniş uyarma ve emisyon spektrumları (yarı maksimumda tam genişlik (FWHM) ~500 cm-1) nedeniyle aynı anda yalnızca 4-5 kanalı görselleştirebilen yaygın floresan görüntüleme yönteminin aksine, Raman mikroskobu çok daha dar spektral çizgi genişliği (FWHM ~ 10 cm-1) sergiler ve bu nedenle ölçeklenebilir çokluluk sağlar. Son zamanlarda, dar spektrumdan yararlanarak, elektronik pre-rezonans uyarılmış Raman saçılma (epr-SRS) mikroskobu adı verilen yeni bir Raman mikroskobu şeması geliştirilmiştir ve çoklanmış görüntüleme için güçlü bir strateji sağlanmıştır13. Raman boyalarının elektronik olarak bağlanmış titreşim modlarını araştırarak, epr-SRS, Raman kesitleri üzerinde 10 13 kat ciddi bir iyileştirme etkisi elde eder ve geleneksel Raman mikroskopisinin hassasiyet darboğazının üstesinden gelir (Şekil 1A)13,14,15. Sonuç olarak, epr-SRS’nin tespit sınırı,Raman’ın 13,16 hücrelerinin içindeki spesifik proteinler ve organeller gibi ilginç moleküler belirteçlerin tespit edilmesini sağlayan μM’nin altına itilmiştir. Özellikle, Raman boya konjuge antikorları kullanılarak, hücrelerdeki ve dokulardaki spesifik proteinlerin (immüno-eprSRS olarak adlandırılır) epr-SRS görüntülemesi, standart immünofloresansla karşılaştırılabilir duyarlılıkla gösterilmiştir (Şekil 1B)13,17. Pompa dalga boyunu sadece 2 nm ayarlayarak, epr-SRS sinyali tamamen kapalı olacaktır (Şekil 1B), bu da yüksek titreşim kontrastını gösterir.
Prob tarafında, antikor konjugasyonu13,18,19,20 için Manhattan Raman saçılma (MARS) boyaları adı verilen bir dizi gökkuşağı benzeri Raman probu geliştirilmiştir. Bu eşsiz Raman paleti, her biri biyoortogonal Raman spektral aralığında tek ve dar bir epr-SRS zirvesi gösteren π konjuge üçlü bağları (Ek Malzeme) taşıyan yeni boyalardan oluşur (Şekil 1C). Çekirdek kromoforun yapısını değiştirerek ve üçlü bağın her iki atomunu izotopik olarak düzenleyerek (Ek Malzeme), spektral olarak ayrılmış Raman probları geliştirilmiştir. Ölçeklenebilir çokluluktan yararlanan epr-SRS mikroskopisi, MARS boya paleti ile birleştiğinde, hücrelerde ve dokularda tek atışlık multipleks protein görüntüleme için optik bir strateji sunar.
İmmüno-eprSRS, kendine özgü güçlü yönleri olan mevcut multipleks protein görüntüleme yöntemlerine alternatif bir strateji sunmaktadır. Döngüsel boyama, görüntüleme ve sinyal giderme ile floresan yaklaşımlarıyla karşılaştırıldığında, bu Raman tabanlı platform tek yuvarlak boyama ve görüntüleme sağlar. Bu nedenle, döngüsel prosedürlerdeki pratik karmaşıklığı ortadan kaldırır ve protokolü büyük ölçüde basitleştirir, böylece çoklanmış protein görüntülemenin yeni bölgelerini açar. Örneğin, Raman boyasına özel bir doku temizleme protokolünden yararlanan immüno-eprSRS, kalın bozulmamış dokularda yüksek oranda çoklanmış protein haritalaması için üç boyuta genişletilmiştir17. 10’dan fazla protein hedefi, milimetre kalınlığındaki fare beyin dokuları boyunca görselleştirildi17. Daha yakın zamanlarda, immüno-eprSRS’nin optimize edilmiş bir biyomolekül retansiyon genleşme mikroskobu (ExM) protokolü21 ile bağlanması, çoklu hedeflerin tek atışlık nano ölçekli görüntülenmesi de gösterilmiştir22. Görüntüleme kütle spektroskopisi4,9 ile karşılaştırıldığında, epr-SRS tahribatsızdır ve kendinden optik kesitleme yeteneğine sahiptir. Ayrıca, epr-SRS doku taramasında daha zaman verimlidir. Tipik olarak, 0,5 μm piksel boyutuna sahip0,25 mm2’lik bir doku bölgesinin tek bir epr-SRS kanalı için görüntülenmesi yalnızca birkaç dakika sürer. Örneğin, Şekil 4’teki dört SRS kanalı artı dört floresan kanalının toplam görüntüleme süresi yaklaşık 10 dakikadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, taze korunmuş fare dokuları, FFPE insan dokuları ve dondurulmuş fare dokuları dahil olmak üzere yaygın doku tiplerine geniş çapta uygulanabilir olan immüno-eprSRS protokolünü sunuyoruz. İmmüno-eprSRS, Tablo 1’de listelendiği gibi, hücrelerdeki ve dokulardaki epitoplardan oluşan bir panel için doğrulanmıştır. Bu tek atışlık platform, döngüsel stratejilerin iyi çalışmadığı uygulamalar için özellikle uygundur. Örneğin, döngüsel floresan kalın dokular için tal…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ruth A. Singer ve Richard K.P. Benninger’e fare pankreas dokuları sağladıkları için teşekkür ederiz. W.M., NIH R01 (GM128214), R01 (GM132860), R01 (EB029523) ve ABD Ordusu’nun (W911NF-19-1-0214) desteğini kabul etmektedir.
Materials
| 16% Paraformaldehyde, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| α-tubulin | Abcam | ab18251 | Primary antibodies |
| α-tubulin | BioLegend | 625902 | Primary antibodies |
| β-III-tubulin | BioLegend | 657402 | Primary antibodies |
| β-III-tubulin | Abcam | ab41489 | Primary antibodies |
| β-tubulin | Abcam | ab131205 | Primary antibodies |
| Agarose, low gellling temperature | Sigma Aldrich | A9414 | For brain embedding |
| Anti-a-tubulin antibody produced in rabbit (α-tubulin) | Abcam | ab52866 | Primary antibodies |
| Anti-Calbindin antibody produced in mouse (Calbindin) | Abcam | ab82812 | Primary antibodies |
| Anti-GABA B receptor R2 antibody produced in guinea pig (GABA B receptor R2) | Millipore Sigma | AB2255 | Primary antibodies |
| Anti-GFAP antibody produced in goat (GFAP) | Thermo Scientific | PA5-18598 | Primary antibodies |
| Anti-Glucagon antibody produced in mouse (Glucagon) | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Primary antibodies |
| Anti-insulin antibody produced in guinea pig (insulin) | DAKO | IR00261-2 | Primary antibodies |
| Anti-MBP antibody produced in rat (MBP) | Abcam | ab7349 | Primary antibodies |
| Anti-NeuN antibody produced in rabbit (NeuN) | Thermo Scientific | PA5-78639 | Primary antibodies |
| Anti-Pancreatic polypeptide (PP) antibody produced in goat- Pancreatic polypeptide (PP) | Sigma Aldrich | SAB2500747 | Primary antibodies |
| Anti-Pdx1 antibody produced in rabbit (Pdx1) | Milipore | 06-1379 | Primary antibodies |
| Anti-Somatostatin antibody produced in rat (Somatostatin) | Abcam | ab30788 | Primary antibodies |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken (Vimentin) | Abcam | ab24525 | Primary antibodies |
| Band-pass filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
| BNC cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male / Male |
| Broadband dielectric mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 – 1100 nm |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Centrifuge | |||
| Condenser | Olympus | oil immersion, 1.4 N.A. | |
| Cytokeratin 18 | Abcam | ab7797 | Primary antibodies |
| Cytokeratin 18 | Abcam | ab24561 | Primary antibodies |
| DC power supply | TopWard | 6302D | Bias voltage is 64 V |
| Dichroic mount | Thorlabs | KM100CL | Kinematic Mount for up to 1.3" (33 mm) Tall Rectangular Optics, Left Handed |
| Donkey anti-Chicken IgY (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 703-005-155 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-005-147 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Guinea Pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-005-148 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-005-151 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-005-152 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-005-153 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Sheep IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 713-005-147 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| DPBS | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| EpCAM | Abcam | ab71916 | Primary antibodies |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 443611 | |
| Fast-speed look-in amplifier | Zurich Instruments | HF2LI | DC – 50 MHz |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Fibrillarin | Abcam | ab5821 | Primary antibodies |
| Giantin | Abcam | ab24586 | Primary antibodies |
| Glucagon | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Primary antibodies |
| H2B | Abcam | ab1790 | Primary antibodies |
| HeLa | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| High O.D. bandpass filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
| Hydrophobic pen | Fisher Scientific | NC1384846 | |
| Insulin | ThermoFisher | 701265 | Primary antibodies |
| Integrated SRS laser system | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse train at 1,064 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1,064-nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulse trains is achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
| Inverted laser-scanning microscope | Olympus | FV1200MPE | |
| Kinematic mirror mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) | Sigma Aldrich | L0636-5 mg | |
| Long-pass dichroic beam splitter | Semrock | Di02-R980-25×36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
| MAP2 | BioLegend | 801810 | Primary antibodies |
| Microscopy imaging software | Olympus | FluoView | |
| NanoQuant Plate | Tecan | For absorbance-based, small volume analyses in a plate reader. | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Thermo Scientific | R37606 | |
| Nunc 4-Well Dishes | Fisher Scientific | 12-566-300 | |
| Objective lens | Olympus | XLPlan N | x25, 1.05-NA, MP, working distance = 2 mm |
| Paint brush | |||
| Periscope assembly | Thorlabs | RS99 | includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
| pH meter | |||
| Plate reader | Tecan | Infinite 200 PRO | An easy-to-use multimode plate reader. Absorbance measurement capabilities over a spectral range of 230–1000 nm. |
| ProLong Gold antifade reagent | Thermo Scientific | P36930 | |
| PSD95 | Invitrogen | 51-6900 | Primary antibodies |
| Sephadex G-25 Medium | GE Life Sciences | 17-0033-01 | gel filtration resin for desalting and buffer exchange |
| Shielded box with BNC connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box With Cover, BNC Female/Female |
| Si photodiode | Thorlabs | FDS1010 | 350–1100 nm, 10 mm x 10 mm Active Area |
| Synapsin 2 | ThermoFisher | OSS00073G | Primary antibodies |
| Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides | Fisher Scientific | 22-035813 | Adhesive slide to attract and chemically bond fresh or formalin-fixed tissue sections firmly to the slide surface (tiisue bindling glass slides) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Vibratome | Leica | VT1000 | |
| Vimentin | Abcam | ab8069 | Primary antibodies |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
References
- Goltsev, Y., et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
- Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (1), 000155 (2020).
- Lewis, S. M., et al. Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology. Nature Methods. 18 (9), 997-1012 (2021).
- Bodenmiller, B. Multiplexed epitope-based tissue imaging for discovery and healthcare applications. Cell Systems. 2 (4), 225-238 (2016).
- Hickey, J. W., et al. Spatial mapping of protein composition and tissue organization: a primer for multiplexed antibody-based imaging. Nature Methods. , (2021).
- Lin, J. -. R., et al. Highly multiplexed immunofluorescence imaging of human tissues and tumors using t-CyCIF and conventional optical microscopes. eLife. 7, 31657 (2018).
- Black, S., et al. CODEX multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies. Nature Protocols. 16 (8), 3802-3835 (2021).
- Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
- Keren, L., et al. MIBI-TOF: A multiplexed imaging platform relates cellular phenotypes and tissue structure. Science Advances. 5 (10), 5851 (2019).
- Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982 (2013).
- Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
- Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33455 (2020).
- Wei, L., et al. Super-multiplex vibrational imaging. Nature. 544, 465 (2017).
- Wei, L., Min, W. Electronic preresonance stimulated Raman scattering microscopy. The Journal of Physical Chemistry Letters. 9 (15), 4294-4301 (2018).
- Shi, L., et al. Electronic resonant stimulated Raman scattering micro-spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (39), 9218-9224 (2018).
- Fujioka, H., et al. Multicolor activatable Raman probes for simultaneous detection of plural enzyme activities. Journal of the American Chemical Society. 142 (49), 20701-20707 (2020).
- Shi, L., et al. Highly-multiplexed volumetric mapping with Raman dye imaging and tissue clearing. Nature Biotechnology. , (2021).
- Miao, Y., Qian, N., Shi, L., Hu, F., Min, W. 9-Cyanopyronin probe palette for super-multiplexed vibrational imaging. Nature Communications. 12 (1), 4518 (2021).
- Miao, Y., Shi, L., Hu, F., Min, W. Probe design for super-multiplexed vibrational imaging. Physical Biology. 16 (4), 041003 (2019).
- Qian, N., Min, W. Super-multiplexed vibrational probes: Being colorful makes a difference. Current Opinion in Chemical Biology. 67, 102115 (2022).
- Klimas, A., et al. Nanoscale imaging of biomolecules using molecule anchorable gel-enabled nanoscale in-situ fluorescence microscopy. Nature Portfolio. , (2021).
- Shi, L., et al. Super-resolution vibrational imaging using expansion stimulated Raman scattering microscopy. bioRxiv. , (2021).
- Benninger, R. K. P., Hodson, D. J. New understanding of β-cell heterogeneity and in situ islet function. Diabetes. 67 (4), 537 (2018).
- Hu, F., et al. Supermultiplexed optical imaging and barcoding with engineered polyynes. Nature Methods. 15 (3), 194-200 (2018).
- Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
- . Coherent Raman Scattering Microscope Available from: https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/ (2022)
