रमन रंजक के साथ अत्यधिक मल्टीप्लेक्स ऊतक इमेजिंग
Summary
इलेक्ट्रॉनिक पूर्व अनुनाद उत्तेजित रमन प्रकीर्णन (epr-SRS) इंद्रधनुष की तरह रमन रंजक की इमेजिंग अत्यधिक multiplexed एपिटोप आधारित प्रोटीन इमेजिंग के लिए एक नया मंच है. यहां, हम एंटीबॉडी तैयारी, ऊतक नमूना धुंधला, एसआरएस माइक्रोस्कोप असेंबली और ईपीआर-एसआरएस ऊतक इमेजिंग सहित एक व्यावहारिक मार्गदर्शिका प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
ऊतकों में विशिष्ट बायोमाकर्स के विशाल दायरे की कल्पना करना जटिल जैविक प्रणालियों के जटिल संगठनों की खोज में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इसलिए, अत्यधिक मल्टीप्लेक्स इमेजिंग प्रौद्योगिकियों की तेजी से सराहना की गई है। यहां, हम इलेक्ट्रॉनिक पूर्व-अनुनाद उत्तेजित रमन प्रकीर्णन (ईपीआर-एसआरएस) इंद्रधनुष जैसे रमन रंजक के इमेजिंग के माध्यम से मानक इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए तुलनीय संवेदनशीलता के साथ विशिष्ट प्रोटीन के अत्यधिक-मल्टीप्लेक्स कंपन इमेजिंग के एक उभरते हुए मंच का वर्णन करते हैं। यह विधि पारंपरिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस में वर्णक्रमीय-समाधान योग्य चैनलों की सीमा को दरकिनार करती है और उपकोशिकीय रिज़ॉल्यूशन के साथ ऊतकों में कई मार्करों से पूछताछ करने के लिए एक-शॉट ऑप्टिकल दृष्टिकोण प्रदान करती है। यह आम तौर पर मानक ऊतक तैयारी के साथ संगत है, जिसमें पैराफॉर्मेल्डिहाइड-फिक्स्ड ऊतक, जमे हुए ऊतक, और फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) मानव ऊतक शामिल हैं। हम इस मंच की परिकल्पना जैविक नमूनों के प्रोटीन इंटरैक्शन की एक और अधिक व्यापक तस्वीर प्रदान करेगा, विशेष रूप से मोटी बरकरार ऊतकों के लिए। यह प्रोटोकॉल एंटीबॉडी की तैयारी से ऊतक नमूना धुंधला करने के लिए, एसआरएस माइक्रोस्कोप असेंबली के लिए, ईपीआर-एसआरएस ऊतक इमेजिंग के लिए वर्कफ़्लो प्रदान करता है।
Introduction
जटिल ऊतक प्रणालियां अलग-अलग सेलुलर उप-आबादी से बनी होती हैं जिनके स्थानिक स्थान और इंटरैक्शन नेटवर्क उनके कार्यों औरशिथिलताओं 1,2 के साथ गहराई से जुड़े होते हैं। ऊतक वास्तुकला को प्रकट करने और इसकी जटिलता से पूछताछ करने के लिए, एकल-कोशिका संकल्प पर प्रोटीन के स्थानिक स्थानों का ज्ञान आवश्यक है। इसलिए, अत्यधिक मल्टीप्लेक्स्ड प्रोटीन-इमेजिंग प्रौद्योगिकियों की तेजी से सराहना की गई है और ऊतक जीव विज्ञान 3,4,5 का अध्ययन करने के लिए एक आधारशिला बन सकती है। वर्तमान आम मल्टीप्लेक्स प्रोटीन इमेजिंग विधियों को दो मुख्य श्रेणियों में वर्गीकृत किया जा सकता है। एक सीरियल इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग ऊतक धुंधला और इमेजिंग के कई दौर पर निर्भर करता है, और दूसरा इमेजिंग मास साइटोमेट्री है जो भारी धातु टैग किए गए एंटीबॉडी 6,7,8,9,10,11,12 के साथ युग्मित है।
यहां, मल्टीप्लेक्स्ड एंटीबॉडी-आधारित प्रोटीन इमेजिंग के लिए एक वैकल्पिक रणनीति पेश की गई है। प्रचलित प्रतिदीप्ति इमेजिंग रूपरेखा के विपरीत, जो केवल व्यापक उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा (आधे अधिकतम (एफडब्ल्यूएचएम) ~ 500 सेमी -1 पर पूर्ण चौड़ाई) के कारण एक साथ 4-5 चैनलों की कल्पना कर सकता है, रमन माइक्रोस्कोपी बहुत संकीर्ण वर्णक्रमीय लाइनचौड़ाई (एफडब्ल्यूएचएम ~ 10 सेमी -1) प्रदर्शित करता है और इसलिए स्केलेबल मल्टीप्लेक्सिटी प्रदान करता है। हाल ही में, संकीर्ण स्पेक्ट्रम का उपयोग करके, रमन माइक्रोस्कोपी की एक उपन्यास योजना जिसका नाम इलेक्ट्रॉनिक प्री-रेजोनेंस प्रेरित रमन स्कैटरिंग (ईपीआर-एसआरएस) माइक्रोस्कोपी है, जो मल्टीप्लेक्स इमेजिंग13 के लिए एक शक्तिशाली रणनीति प्रदान करता है। रमन रंजक के इलेक्ट्रॉनिक रूप से युग्मित कंपन मोड की जांच करके, ईपीआर-एसआरएस रमन क्रॉस-सेक्शन पर 1013-गुना का एक कठोर वृद्धि प्रभाव प्राप्त करता है और पारंपरिक रमन माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1 ए) 13,14,15 की संवेदनशीलता बाधा को दूर करता है। नतीजतन, ईपीआर-एसआरएस की पहचान सीमा को उप-μM पर धकेल दिया गया है, जो रमन को13,16 कोशिकाओं के अंदर विशिष्ट प्रोटीन और ऑर्गेनेल जैसे दिलचस्प आणविक मार्करों का पता लगाने में सक्षम बनाता है। विशेष रूप से, रमन डाई-संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए, कोशिकाओं और ऊतकों में विशिष्ट प्रोटीन की ईपीआर-एसआरएस इमेजिंग (जिसे इम्यूनो-ईपीआरएसआरएस कहा जाता है) को मानक इम्यूनोफ्लोरेसेंस (चित्रा 1 बी) 13,17 के लिए तुलनीय संवेदनशीलता के साथ प्रदर्शित किया गया था। केवल 2 एनएम द्वारा पंप तरंग दैर्ध्य ट्यूनिंग करके, ईपीआर-एसआरएस सिग्नल पूरी तरह से बंद हो जाएगा (चित्रा 1 बी), जो उच्च कंपन विपरीत दिखाता है।
जांच पक्ष पर, इंद्रधनुष की तरह रमन जांच का एक सेट मैनहट्टन रमन प्रकीर्णन (MARS) रंग कहा जाता है एंटीबॉडी संयुग्मन13,18,19,20 के लिए विकसित किया गया है। इस अद्वितीय रमन पैलेट में π-संयुग्मित ट्रिपल बॉन्ड (पूरक सामग्री) वाले उपन्यास रंजक होते हैं, जिनमें से प्रत्येक बायोऑर्थोगोनल रमन वर्णक्रमीय रेंज (चित्रा 1 सी) में एक एकल और संकीर्ण ईपीआर-एसआरएस चोटी प्रदर्शित करता है। कोर क्रोमोफोर की संरचना को संशोधित करके और आइसोटोपिक रूप से ट्रिपल बॉन्ड (पूरक सामग्री) के दोनों परमाणुओं को संपादित करके, वर्णक्रमीय रूप से अलग किए गए रमन जांच विकसित किए गए हैं। स्केलेबल मल्टीप्लेक्सिटी का लाभ उठाते हुए, ईपीआर-एसआरएस माइक्रोस्कोपी मार्स डाई पैलेट के साथ मिलकर कोशिकाओं और ऊतकों में एक शॉट मल्टीप्लेक्स प्रोटीन इमेजिंग के लिए एक ऑप्टिकल रणनीति प्रदान करता है।
Immuno-eprSRS अद्वितीय शक्तियों के साथ वर्तमान मल्टीप्लेक्स प्रोटीन इमेजिंग विधियों के लिए एक वैकल्पिक रणनीति प्रदान करता है। चक्रीय धुंधला, इमेजिंग और सिग्नल हटाने के साथ प्रतिदीप्ति दृष्टिकोण की तुलना में, यह रमन-आधारित प्लेटफ़ॉर्म एकल-दौर धुंधला और इमेजिंग सुनिश्चित करता है। इसलिए, यह चक्रीय प्रक्रियाओं में व्यावहारिक जटिलता को दरकिनार करता है और काफी हद तक प्रोटोकॉल को सरल बनाता है, इसलिए मल्टीप्लेक्स प्रोटीन इमेजिंग के नए क्षेत्रों को खोलता है। उदाहरण के लिए, एक रमन-डाई-सिलवाया ऊतक समाशोधन प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, इम्यूनो-eprSRS को मोटे बरकरार ऊतकों में अत्यधिक मल्टीप्लेक्स प्रोटीन मैपिंग के लिए तीन आयामों तक बढ़ाया गयाहै। मिलीमीटर-मोटी माउस मस्तिष्क के ऊतकों के साथ 10 से अधिक प्रोटीनलक्ष्यों की कल्पना की गई थी। हाल ही में, एक अनुकूलित बायोमोलेक्यूल-प्रतिधारण विस्तार माइक्रोस्कोपी (ExM) प्रोटोकॉल21 के साथ इम्युनो-eprSRS युग्मन, कई लक्ष्यों के एक-शॉट नैनोस्केल इमेजिंग को भी प्रदर्शित किया गया है। इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोस्कोपी 4,9 की तुलना में, ईपीआर-एसआरएस गैर-विनाशकारी है और इसमें आंतरिक रूप से ऑप्टिकल सेक्शनिंग क्षमता है। इसके अलावा, ईपीआर-एसआरएस ऊतक स्कैनिंग पर अधिक समय-कुशल है। आमतौर पर, 0.5 μm के पिक्सेल आकार के साथ0.25 मिमी 2 का एक ऊतक क्षेत्र एक एकल epr-SRS चैनल के लिए छवि के लिए केवल कुछ मिनट लेता है। उदाहरण के लिए, चित्रा 4 में चार एसआरएस चैनलों के साथ-साथ चार प्रतिदीप्ति चैनलों का कुल इमेजिंग समय लगभग 10 मिनट है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हम इम्यूनो-ईपीआरएसआरएस प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो मोटे तौर पर सामान्य ऊतक प्रकारों पर लागू होता है, जिसमें ताजा संरक्षित माउस ऊतक, एफएफपीई मानव ऊतक और जमे हुए माउस ऊतक शामिल हैं। इम्यूनो-eprSRS क?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम रूथ ए सिंगर और रिचर्ड के.पी. बेनिंगर को माउस अग्न्याशय ऊतक प्रदान करने के लिए धन्यवाद देते हैं। W.M. NIH R01 (GM128214), R01 (GM132860), R01 (EB029523) और अमेरिकी सेना (W911NF-19-1-0214) से समर्थन स्वीकार करता है।
Materials
| 16% Paraformaldehyde, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| α-tubulin | Abcam | ab18251 | Primary antibodies |
| α-tubulin | BioLegend | 625902 | Primary antibodies |
| β-III-tubulin | BioLegend | 657402 | Primary antibodies |
| β-III-tubulin | Abcam | ab41489 | Primary antibodies |
| β-tubulin | Abcam | ab131205 | Primary antibodies |
| Agarose, low gellling temperature | Sigma Aldrich | A9414 | For brain embedding |
| Anti-a-tubulin antibody produced in rabbit (α-tubulin) | Abcam | ab52866 | Primary antibodies |
| Anti-Calbindin antibody produced in mouse (Calbindin) | Abcam | ab82812 | Primary antibodies |
| Anti-GABA B receptor R2 antibody produced in guinea pig (GABA B receptor R2) | Millipore Sigma | AB2255 | Primary antibodies |
| Anti-GFAP antibody produced in goat (GFAP) | Thermo Scientific | PA5-18598 | Primary antibodies |
| Anti-Glucagon antibody produced in mouse (Glucagon) | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Primary antibodies |
| Anti-insulin antibody produced in guinea pig (insulin) | DAKO | IR00261-2 | Primary antibodies |
| Anti-MBP antibody produced in rat (MBP) | Abcam | ab7349 | Primary antibodies |
| Anti-NeuN antibody produced in rabbit (NeuN) | Thermo Scientific | PA5-78639 | Primary antibodies |
| Anti-Pancreatic polypeptide (PP) antibody produced in goat- Pancreatic polypeptide (PP) | Sigma Aldrich | SAB2500747 | Primary antibodies |
| Anti-Pdx1 antibody produced in rabbit (Pdx1) | Milipore | 06-1379 | Primary antibodies |
| Anti-Somatostatin antibody produced in rat (Somatostatin) | Abcam | ab30788 | Primary antibodies |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken (Vimentin) | Abcam | ab24525 | Primary antibodies |
| Band-pass filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
| BNC cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male / Male |
| Broadband dielectric mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 – 1100 nm |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Centrifuge | |||
| Condenser | Olympus | oil immersion, 1.4 N.A. | |
| Cytokeratin 18 | Abcam | ab7797 | Primary antibodies |
| Cytokeratin 18 | Abcam | ab24561 | Primary antibodies |
| DC power supply | TopWard | 6302D | Bias voltage is 64 V |
| Dichroic mount | Thorlabs | KM100CL | Kinematic Mount for up to 1.3" (33 mm) Tall Rectangular Optics, Left Handed |
| Donkey anti-Chicken IgY (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 703-005-155 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-005-147 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Guinea Pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-005-148 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-005-151 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-005-152 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-005-153 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Sheep IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 713-005-147 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| DPBS | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| EpCAM | Abcam | ab71916 | Primary antibodies |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 443611 | |
| Fast-speed look-in amplifier | Zurich Instruments | HF2LI | DC – 50 MHz |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Fibrillarin | Abcam | ab5821 | Primary antibodies |
| Giantin | Abcam | ab24586 | Primary antibodies |
| Glucagon | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Primary antibodies |
| H2B | Abcam | ab1790 | Primary antibodies |
| HeLa | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| High O.D. bandpass filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
| Hydrophobic pen | Fisher Scientific | NC1384846 | |
| Insulin | ThermoFisher | 701265 | Primary antibodies |
| Integrated SRS laser system | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse train at 1,064 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1,064-nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulse trains is achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
| Inverted laser-scanning microscope | Olympus | FV1200MPE | |
| Kinematic mirror mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) | Sigma Aldrich | L0636-5 mg | |
| Long-pass dichroic beam splitter | Semrock | Di02-R980-25×36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
| MAP2 | BioLegend | 801810 | Primary antibodies |
| Microscopy imaging software | Olympus | FluoView | |
| NanoQuant Plate | Tecan | For absorbance-based, small volume analyses in a plate reader. | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Thermo Scientific | R37606 | |
| Nunc 4-Well Dishes | Fisher Scientific | 12-566-300 | |
| Objective lens | Olympus | XLPlan N | x25, 1.05-NA, MP, working distance = 2 mm |
| Paint brush | |||
| Periscope assembly | Thorlabs | RS99 | includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
| pH meter | |||
| Plate reader | Tecan | Infinite 200 PRO | An easy-to-use multimode plate reader. Absorbance measurement capabilities over a spectral range of 230–1000 nm. |
| ProLong Gold antifade reagent | Thermo Scientific | P36930 | |
| PSD95 | Invitrogen | 51-6900 | Primary antibodies |
| Sephadex G-25 Medium | GE Life Sciences | 17-0033-01 | gel filtration resin for desalting and buffer exchange |
| Shielded box with BNC connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box With Cover, BNC Female/Female |
| Si photodiode | Thorlabs | FDS1010 | 350–1100 nm, 10 mm x 10 mm Active Area |
| Synapsin 2 | ThermoFisher | OSS00073G | Primary antibodies |
| Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides | Fisher Scientific | 22-035813 | Adhesive slide to attract and chemically bond fresh or formalin-fixed tissue sections firmly to the slide surface (tiisue bindling glass slides) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Vibratome | Leica | VT1000 | |
| Vimentin | Abcam | ab8069 | Primary antibodies |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
References
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