Elektronisk pre-resonans stimulert Raman spredning (epr-SRS) avbildning av regnbue-lignende Raman fargestoffer er en ny plattform for svært multiplekset epitop-basert protein avbildning. Her presenterer vi en praktisk guide, inkludert antistoffpreparat, vevsprøvefarging, SRS mikroskopmontering og epr-SRS vevsavbildning.
Visualisering av et stort omfang av spesifikke biomarkører i vev spiller en viktig rolle i å utforske de intrikate organisasjonene av komplekse biologiske systemer. Derfor har svært multipleksede bildeteknologier blitt stadig mer verdsatt. Her beskriver vi en ny plattform med svært multippelxed vibrasjonsavbildning av spesifikke proteiner med sammenlignbar følsomhet for standard immunfluorescens via elektronisk pre-resonans stimulert Raman spredning (epr-SRS) bildebehandling av regnbuelignende Raman fargestoffer. Denne metoden omgår grensen for spektralt løselige kanaler i konvensjonell immunfluorescence og gir en ett-skudds optisk tilnærming for å forhøre flere markører i vev med subcellulær oppløsning. Det er generelt kompatibelt med standard vevspreparater, inkludert paraformaldehydfast vev, frossent vev og formalin-fast parafin-innebygd (FFPE) humant vev. Vi ser for oss at denne plattformen vil gi et mer omfattende bilde av proteininteraksjoner av biologiske prøver, spesielt for tykt intakt vev. Denne protokollen gir arbeidsflyten fra antistoffpreparat til vevsprøvefarging, til SRS mikroskopmontering, til epr-SRS vevsavbildning.
Komplekse vevssystemer består av distinkte cellulære subpopulasjoner hvis romlige steder og interaksjonsnettverk er dypt sammenflettet med deres funksjoner og dysfunksjoner 1,2. For å avsløre vevsarkitekturen og forhøre kompleksiteten, er kunnskap om de romlige plasseringene av proteiner ved encellet oppløsning viktig. Derfor har svært multipleksede proteinavbildningsteknologier blitt stadig mer verdsatt og kan bli en hjørnestein for å studere vevsbiologi 3,4,5. Nåværende vanlige multipleksede proteinavbildningsmetoder kan klassifiseres i to hovedkategorier. Den ene er seriell immunfluorescensavbildning som er avhengig av flere runder med vevsfarging og avbildning, og den andre er bildemassecytometri kombinert med tungmetallmerkede antistoffer 6,7,8,9,10,11,12.
Her innføres en alternativ strategi for multiplekset antistoffbasert proteinavbildning. I motsetning til den utbredte fluorescensavbildningsmodaliteten, som bare kan visualisere 4-5 kanaler samtidig på grunn av den brede eksitasjonen og utslippsspektraet (full bredde ved halv maksimum (FWHM) ~ 500 cm-1), viser Raman-mikroskopi mye smalere spektral linewidth (FWHM ~ 10 cm-1) og gir dermed skalerbar multipleksitet. Nylig, ved å utnytte det smale spekteret, har en ny ordning med Raman-mikroskopi kalt elektronisk pre-resonans stimulert Raman-spredning (epr-SRS) mikroskopi blitt utviklet, noe som gir en kraftig strategi for multiplekset bildebehandling13. Ved å undersøke de elektronisk koblede vibrasjonsmodusene til Raman-fargestoffer oppnår epr-SRS en drastisk forbedringseffekt på10 13 ganger på Raman-tverrsnitt og overvinner følsomhetsflaskehalsen til konvensjonell Raman-mikroskopi (figur 1A)13,14,15. Som et resultat har deteksjonsgrensen for epr-SRS blitt presset til sub-μM, noe som muliggjør Raman-deteksjon av interessante molekylære markører som spesifikke proteiner og organeller inne i cellene13,16. Spesielt ved bruk av Raman fargestoffkonjugede antistoffer ble epr-SRS-avbildning av spesifikke proteiner i celler og vev (kalt immuno-eprSRS) demonstrert med sammenlignbar følsomhet for standard immunfluorescens (figur 1B) 13,17. Ved å justere pumpebølgelengden med bare 2 nm, vil epr-SRS-signalet være helt av (figur 1B), som viser høy vibrasjonskontrast.
På sondesiden er det utviklet et sett med regnbuelignende Raman-sonder kalt Manhattan Raman-spredning (MARS) fargestoffer for antistoffkonjugering 13,18,19,20. Denne unike Raman-paletten består av nye fargestoffer som bærer π-konjugiserte trippelbindinger (tilleggsmateriale), som hver viser en enkelt og smal epr-SRS-topp i det bioortogonale Raman-spektralområdet (figur 1C). Ved å modifisere strukturen til kjernekromoforen og isotopisk redigere begge atomene av trippelbindingen (supplementært materiale), er det utviklet spektralt separerte Raman-sonder. Ved hjelp av den skalerbare multipleksiteten tilbyr epr-SRS-mikroskopi kombinert med MARS-fargepaletten en optisk strategi for ett-skudds multipleksproteinavbildning i celler og vev.
Immuno-eprSRS gir en alternativ strategi for dagens multipleks proteinavbildningsmetoder med unike styrker. Sammenlignet med fluorescens tilnærminger med syklisk farging, avbildning og signalfjerning, sikrer denne Raman-baserte plattformen en-rund farging og avbildning. Derfor omgår den praktisk kompleksitet i sykliske prosedyrer og forenkler i stor grad protokollen, og åpner dermed nye territorier for multiplekset proteinavbildning. For eksempel, ved å utnytte en Raman-farget-skreddersydd vevsryddingsprotokoll, har immuno-eprSRS blitt utvidet til tre dimensjoner for svært multiplekset proteinkartlegging i tykt intakt vev17. Over 10 proteinmål ble visualisert langs millimeter tykk musehjernevev17. Mer nylig, kobling immuno-eprSRS med en optimalisert biomolekyl-oppbevaring ekspansjon mikroskopi (ExM) protokoll21, ett-skudd nanoskala bildebehandling av flere mål har også blitt demonstrert22. Sammenlignet med avbildningsmassespektroskopi 4,9, er epr-SRS ikke-ødeleggende og har iboende optisk seksjoneringsevne. Videre er epr-SRS mer tidseffektiv på vevsskanning. Vanligvis tar et vevsområde på 0,25 mm2 med en pikselstørrelse på 0,5 μm bare noen få minutter å bilde for en enkelt epr-SRS-kanal. For eksempel er den totale bildetiden til fire SRS-kanaler pluss fire fluorescenskanaler i figur 4 ca. 10 min.
Her presenterer vi immuno-eprSRS-protokollen som i stor grad gjelder for vanlige vevstyper, inkludert ferskt bevart musevev, FFPE-humant vev og frossent musevev. Immuno-eprSRS er validert for et panel av epitoper i celler og vev, som oppført i tabell 1. Denne one-shot plattformen er spesielt egnet for applikasjoner der sykliske strategier ikke fungerer bra. For eksempel er syklisk fluorescens krevende for tykt vev, da flere runder med 3D-immunisolering er upraktisk lang17. Det er…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Ruth A. Singer og Richard K.P. Benninger for å ha gitt mus bukspyttkjertelvev. W.M. anerkjenner støtte fra NIH R01 (GM128214), R01 (GM132860), R01 (EB029523) og US Army (W911NF-19-1-0214).
16% Paraformaldehyde, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
α-tubulin | Abcam | ab18251 | Primary antibodies |
α-tubulin | BioLegend | 625902 | Primary antibodies |
β-III-tubulin | BioLegend | 657402 | Primary antibodies |
β-III-tubulin | Abcam | ab41489 | Primary antibodies |
β-tubulin | Abcam | ab131205 | Primary antibodies |
Agarose, low gellling temperature | Sigma Aldrich | A9414 | For brain embedding |
Anti-a-tubulin antibody produced in rabbit (α-tubulin) | Abcam | ab52866 | Primary antibodies |
Anti-Calbindin antibody produced in mouse (Calbindin) | Abcam | ab82812 | Primary antibodies |
Anti-GABA B receptor R2 antibody produced in guinea pig (GABA B receptor R2) | Millipore Sigma | AB2255 | Primary antibodies |
Anti-GFAP antibody produced in goat (GFAP) | Thermo Scientific | PA5-18598 | Primary antibodies |
Anti-Glucagon antibody produced in mouse (Glucagon) | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Primary antibodies |
Anti-insulin antibody produced in guinea pig (insulin) | DAKO | IR00261-2 | Primary antibodies |
Anti-MBP antibody produced in rat (MBP) | Abcam | ab7349 | Primary antibodies |
Anti-NeuN antibody produced in rabbit (NeuN) | Thermo Scientific | PA5-78639 | Primary antibodies |
Anti-Pancreatic polypeptide (PP) antibody produced in goat- Pancreatic polypeptide (PP) | Sigma Aldrich | SAB2500747 | Primary antibodies |
Anti-Pdx1 antibody produced in rabbit (Pdx1) | Milipore | 06-1379 | Primary antibodies |
Anti-Somatostatin antibody produced in rat (Somatostatin) | Abcam | ab30788 | Primary antibodies |
Anti-Vimentin antibody produced in chicken (Vimentin) | Abcam | ab24525 | Primary antibodies |
Band-pass filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
BNC cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male / Male |
Broadband dielectric mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 – 1100 nm |
C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
Centrifuge | |||
Condenser | Olympus | oil immersion, 1.4 N.A. | |
Cytokeratin 18 | Abcam | ab7797 | Primary antibodies |
Cytokeratin 18 | Abcam | ab24561 | Primary antibodies |
DC power supply | TopWard | 6302D | Bias voltage is 64 V |
Dichroic mount | Thorlabs | KM100CL | Kinematic Mount for up to 1.3" (33 mm) Tall Rectangular Optics, Left Handed |
Donkey anti-Chicken IgY (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 703-005-155 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
Donkey anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-005-147 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
Donkey anti-Guinea Pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-005-148 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-005-151 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-005-152 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
Donkey anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-005-153 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
Donkey anti-Sheep IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 713-005-147 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
DPBS | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
EpCAM | Abcam | ab71916 | Primary antibodies |
Ethanol | Sigma Aldrich | 443611 | |
Fast-speed look-in amplifier | Zurich Instruments | HF2LI | DC – 50 MHz |
FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
Fibrillarin | Abcam | ab5821 | Primary antibodies |
Giantin | Abcam | ab24586 | Primary antibodies |
Glucagon | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Primary antibodies |
H2B | Abcam | ab1790 | Primary antibodies |
HeLa | ATCC | ATCC CCL-2 | |
High O.D. bandpass filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
Hydrophobic pen | Fisher Scientific | NC1384846 | |
Insulin | ThermoFisher | 701265 | Primary antibodies |
Integrated SRS laser system | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse train at 1,064 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1,064-nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulse trains is achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
Inverted laser-scanning microscope | Olympus | FV1200MPE | |
Kinematic mirror mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
Lectin from Triticum vulgaris (wheat) | Sigma Aldrich | L0636-5 mg | |
Long-pass dichroic beam splitter | Semrock | Di02-R980-25×36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
MAP2 | BioLegend | 801810 | Primary antibodies |
Microscopy imaging software | Olympus | FluoView | |
NanoQuant Plate | Tecan | For absorbance-based, small volume analyses in a plate reader. | |
Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Thermo Scientific | R37606 | |
Nunc 4-Well Dishes | Fisher Scientific | 12-566-300 | |
Objective lens | Olympus | XLPlan N | x25, 1.05-NA, MP, working distance = 2 mm |
Paint brush | |||
Periscope assembly | Thorlabs | RS99 | includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
pH meter | |||
Plate reader | Tecan | Infinite 200 PRO | An easy-to-use multimode plate reader. Absorbance measurement capabilities over a spectral range of 230–1000 nm. |
ProLong Gold antifade reagent | Thermo Scientific | P36930 | |
PSD95 | Invitrogen | 51-6900 | Primary antibodies |
Sephadex G-25 Medium | GE Life Sciences | 17-0033-01 | gel filtration resin for desalting and buffer exchange |
Shielded box with BNC connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box With Cover, BNC Female/Female |
Si photodiode | Thorlabs | FDS1010 | 350–1100 nm, 10 mm x 10 mm Active Area |
Synapsin 2 | ThermoFisher | OSS00073G | Primary antibodies |
Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides | Fisher Scientific | 22-035813 | Adhesive slide to attract and chemically bond fresh or formalin-fixed tissue sections firmly to the slide surface (tiisue bindling glass slides) |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
Vibratome | Leica | VT1000 | |
Vimentin | Abcam | ab8069 | Primary antibodies |
Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |