Elektronisk pre-resonansstimulerad Raman-spridning (epr-SRS) avbildning av regnbågsliknande Raman-färgämnen är en ny plattform för mycket multiplexerad epitopbaserad proteinavbildning. Här presenterar vi en praktisk guide inklusive antikroppsberedning, vävnadsprovfärgning, SRS-mikroskopmontering och epr-SRS-vävnadsavbildning.
Att visualisera ett stort antal specifika biomarkörer i vävnader spelar en viktig roll för att utforska de invecklade organisationerna i komplexa biologiska system. Därför har mycket multiplexerad bildteknik uppskattats alltmer. Här beskriver vi en framväxande plattform för högmultimulerad vibrationsavbildning av specifika proteiner med jämförbar känslighet för standardimmunfluorescens via elektronisk pre-resonansstimulerad Raman-spridning (epr-SRS) avbildning av regnbågsliknande Raman-färgämnen. Denna metod kringgår gränsen för spektralt upplösbara kanaler i konventionell immunofluorescens och ger en optisk metod med ett skott för att förhöra flera markörer i vävnader med subcellulär upplösning. Det är i allmänhet kompatibelt med standardvävnadspreparat, inklusive paraformaldehyd-fasta vävnader, frysta vävnader och formalin-fixerade paraffininbäddade (FFPE) mänskliga vävnader. Vi ser framför oss att denna plattform kommer att ge en mer omfattande bild av proteininteraktioner mellan biologiska prover, särskilt för tjocka intakta vävnader. Detta protokoll ger arbetsflödet från antikroppsberedning till vävnadsprovfärgning, till SRS-mikroskopmontering, till epr-SRS-vävnadsavbildning.
Komplexa vävnadssystem består av distinkta cellulära delpopulationer vars rumsliga platser och interaktionsnätverk är djupt sammanflätade med deras funktioner och dysfunktioner 1,2. För att avslöja vävnadsarkitekturen och förhöra dess komplexitet är kunskap om proteinernas rumsliga placering vid encellsupplösning avgörande. Därför har mycket multiplexerad proteinavbildningsteknik uppskattats alltmer och kan bli en hörnsten för att studera vävnadsbiologi 3,4,5. Nuvarande vanliga multiplexerade proteinavbildningsmetoder kan klassificeras i två huvudkategorier. Den ena är seriell immunofluorescensavbildning som förlitar sig på flera omgångar av vävnadsfärgning och avbildning, och den andra är avbildning av masscytometri i kombination med tungmetallmärkta antikroppar 6,7,8,9,10,11,12.
Här introduceras en alternativ strategi för multiplexerad antikroppsbaserad proteinavbildning. Till skillnad från den rådande fluorescensavbildningsmodaliteten, som bara kan visualisera 4-5 kanaler samtidigt på grund av de breda excitations- och emissionsspektra (full bredd vid halv maximal (FWHM) ~ 500 cm-1), uppvisar Raman-mikroskopi mycket smalare spektral linjebredd (FWHM ~ 10 cm-1) och ger därmed skalbar multiplexitet. Nyligen, genom att utnyttja det smala spektrumet, har ett nytt schema för Raman-mikroskopi med namnet elektronisk pre-resonansstimulerad Raman-spridningsmikroskopi (epr-SRS) utvecklats, vilket ger en kraftfull strategi för multiplexerad avbildning13. Genom att undersöka de elektroniskt kopplade vibrationslägena för Raman-färgämnen uppnår epr-SRS en drastisk förbättringseffekt på 1013-faldigt på Raman-tvärsnitt och övervinner känslighetsflaskhalsen för konventionell Raman-mikroskopi (figur 1A) 13,14,15. Som ett resultat har detektionsgränsen för epr-SRS pressats till sub-μM, vilket möjliggör Raman-detektion av intressanta molekylära markörer såsom specifika proteiner och organeller inuti celler13,16. I synnerhet med användning av Raman-färgkonjugerade antikroppar visades epr-SRS-avbildning av specifika proteiner i celler och vävnader (kallad immuno-eprSRS) med jämförbar känslighet för standardimmunfluorescens (figur 1B)13,17. Genom att ställa in pumpens våglängd med endast 2 nm kommer epr-SRS-signalen att vara helt avstängd (figur 1B), vilket visar hög vibrationskontrast.
På sondsidan har en uppsättning regnbågsliknande Raman-sonder som kallas Manhattan Raman scattering (MARS) färgämnen utvecklats för antikroppskonjugering 13,18,19,20. Denna unika Raman-palett består av nya färgämnen som bär π-konjugerade trippelbindningar (supplementärt material), var och en visar en enda och smal epr-SRS-topp i det bioortogonala Raman-spektralområdet (figur 1C). Genom att modifiera strukturen hos kärnkromoforen och isotopiskt redigera båda atomerna i trippelbindningen (supplementärt material) har spektralt separerade Raman-sonder utvecklats. Genom att utnyttja den skalbara multiplexiteten erbjuder epr-SRS-mikroskopi i kombination med MARS-färgpaletten en optisk strategi för multiplexproteinavbildning med ett skott i celler och vävnader.
Immuno-eprSRS ger en alternativ strategi till nuvarande multiplexproteinavbildningsmetoder med unika styrkor. Jämfört med fluorescensmetoder med cyklisk färgning, avbildning och signalborttagning säkerställer denna Raman-baserade plattform enkelrund färgning och avbildning. Därför kringgår den praktisk komplexitet i cykliska förfaranden och förenklar till stor del protokollet, vilket öppnar nya territorier för multiplexerad proteinavbildning. Till exempel, genom att utnyttja ett Raman-färgämnesskräddarsyrt vävnadsrensningsprotokoll, har immuno-eprSRS utökats till tre dimensioner för mycket multiplexerad proteinkartläggning i tjocka intakta vävnader17. Över 10 proteinmål visualiserades längs millimetertjocka mushjärnvävnader17. På senare tid har koppling av immuno-eprSRS med ett optimerat biomolekylretentionsexpansionsmikroskopiprotokoll (ExM)21, en-skotts nanoskala avbildning av flera mål också visats22. Jämfört med avbildning av masspektroskopi 4,9 är epr-SRS icke-destruktiv och har inneboende optisk sektioneringsförmåga. Dessutom är epr-SRS mer tidseffektivt vid vävnadsskanning. Vanligtvis tar en vävnadsregion på 0,25 mm2 med en pixelstorlek på 0,5 μm bara några minuter att avbilda för en enda epr-SRS-kanal. Till exempel är den totala avbildningstiden för fyra SRS-kanaler plus fyra fluorescenskanaler i figur 4 cirka 10 minuter.
Här presenterar vi immuno-eprSRS-protokollet som i stort sett är tillämpligt på vanliga vävnadstyper, inklusive nybevarade musvävnader, FFPE-mänskliga vävnader och frysta musvävnader. Immuno-eprSRS har validerats för en panel av epitoper i celler och vävnader, enligt tabell 1. Denna one-shot-plattform är särskilt lämplig för applikationer där cykliska strategier inte fungerar bra. Till exempel är cyklisk fluorescens krävande för tjocka vävnader eftersom flera omgångar av 3D-immunmär…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Ruth A. Singer och Richard K.P. Benninger för att de tillhandahåller vävnader i bukspottkörteln i musen. W.M. erkänner stöd från NIH R01 (GM128214), R01 (GM132860), R01 (EB029523) och US Army (W911NF-19-1-0214).
16% Paraformaldehyde, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
α-tubulin | Abcam | ab18251 | Primary antibodies |
α-tubulin | BioLegend | 625902 | Primary antibodies |
β-III-tubulin | BioLegend | 657402 | Primary antibodies |
β-III-tubulin | Abcam | ab41489 | Primary antibodies |
β-tubulin | Abcam | ab131205 | Primary antibodies |
Agarose, low gellling temperature | Sigma Aldrich | A9414 | For brain embedding |
Anti-a-tubulin antibody produced in rabbit (α-tubulin) | Abcam | ab52866 | Primary antibodies |
Anti-Calbindin antibody produced in mouse (Calbindin) | Abcam | ab82812 | Primary antibodies |
Anti-GABA B receptor R2 antibody produced in guinea pig (GABA B receptor R2) | Millipore Sigma | AB2255 | Primary antibodies |
Anti-GFAP antibody produced in goat (GFAP) | Thermo Scientific | PA5-18598 | Primary antibodies |
Anti-Glucagon antibody produced in mouse (Glucagon) | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Primary antibodies |
Anti-insulin antibody produced in guinea pig (insulin) | DAKO | IR00261-2 | Primary antibodies |
Anti-MBP antibody produced in rat (MBP) | Abcam | ab7349 | Primary antibodies |
Anti-NeuN antibody produced in rabbit (NeuN) | Thermo Scientific | PA5-78639 | Primary antibodies |
Anti-Pancreatic polypeptide (PP) antibody produced in goat- Pancreatic polypeptide (PP) | Sigma Aldrich | SAB2500747 | Primary antibodies |
Anti-Pdx1 antibody produced in rabbit (Pdx1) | Milipore | 06-1379 | Primary antibodies |
Anti-Somatostatin antibody produced in rat (Somatostatin) | Abcam | ab30788 | Primary antibodies |
Anti-Vimentin antibody produced in chicken (Vimentin) | Abcam | ab24525 | Primary antibodies |
Band-pass filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
BNC cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male / Male |
Broadband dielectric mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 – 1100 nm |
C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
Centrifuge | |||
Condenser | Olympus | oil immersion, 1.4 N.A. | |
Cytokeratin 18 | Abcam | ab7797 | Primary antibodies |
Cytokeratin 18 | Abcam | ab24561 | Primary antibodies |
DC power supply | TopWard | 6302D | Bias voltage is 64 V |
Dichroic mount | Thorlabs | KM100CL | Kinematic Mount for up to 1.3" (33 mm) Tall Rectangular Optics, Left Handed |
Donkey anti-Chicken IgY (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 703-005-155 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
Donkey anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-005-147 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
Donkey anti-Guinea Pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-005-148 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-005-151 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-005-152 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
Donkey anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-005-153 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
Donkey anti-Sheep IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 713-005-147 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
DPBS | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
EpCAM | Abcam | ab71916 | Primary antibodies |
Ethanol | Sigma Aldrich | 443611 | |
Fast-speed look-in amplifier | Zurich Instruments | HF2LI | DC – 50 MHz |
FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
Fibrillarin | Abcam | ab5821 | Primary antibodies |
Giantin | Abcam | ab24586 | Primary antibodies |
Glucagon | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Primary antibodies |
H2B | Abcam | ab1790 | Primary antibodies |
HeLa | ATCC | ATCC CCL-2 | |
High O.D. bandpass filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
Hydrophobic pen | Fisher Scientific | NC1384846 | |
Insulin | ThermoFisher | 701265 | Primary antibodies |
Integrated SRS laser system | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse train at 1,064 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1,064-nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulse trains is achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
Inverted laser-scanning microscope | Olympus | FV1200MPE | |
Kinematic mirror mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
Lectin from Triticum vulgaris (wheat) | Sigma Aldrich | L0636-5 mg | |
Long-pass dichroic beam splitter | Semrock | Di02-R980-25×36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
MAP2 | BioLegend | 801810 | Primary antibodies |
Microscopy imaging software | Olympus | FluoView | |
NanoQuant Plate | Tecan | For absorbance-based, small volume analyses in a plate reader. | |
Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Thermo Scientific | R37606 | |
Nunc 4-Well Dishes | Fisher Scientific | 12-566-300 | |
Objective lens | Olympus | XLPlan N | x25, 1.05-NA, MP, working distance = 2 mm |
Paint brush | |||
Periscope assembly | Thorlabs | RS99 | includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
pH meter | |||
Plate reader | Tecan | Infinite 200 PRO | An easy-to-use multimode plate reader. Absorbance measurement capabilities over a spectral range of 230–1000 nm. |
ProLong Gold antifade reagent | Thermo Scientific | P36930 | |
PSD95 | Invitrogen | 51-6900 | Primary antibodies |
Sephadex G-25 Medium | GE Life Sciences | 17-0033-01 | gel filtration resin for desalting and buffer exchange |
Shielded box with BNC connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box With Cover, BNC Female/Female |
Si photodiode | Thorlabs | FDS1010 | 350–1100 nm, 10 mm x 10 mm Active Area |
Synapsin 2 | ThermoFisher | OSS00073G | Primary antibodies |
Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides | Fisher Scientific | 22-035813 | Adhesive slide to attract and chemically bond fresh or formalin-fixed tissue sections firmly to the slide surface (tiisue bindling glass slides) |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
Vibratome | Leica | VT1000 | |
Vimentin | Abcam | ab8069 | Primary antibodies |
Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |