一种快速检测RNA编辑的无序列方法
Summary
在基因组尺度上快速检测和可靠地定量RNA编辑事件仍然具有挑战性，目前依赖于直接RNA测序方法。这里描述的实验方案使用微温梯度凝胶电泳（μTGGE）作为检测RNA编辑的简单，快速和便携式方法。
Abstract
RNA编辑是导致RNA转录后序列改变的过程。RNA编辑的检测和定量主要依赖于Sanger测序和RNA测序技术。但是，这些方法可能成本高昂且耗时。在该协议中，便携式微温梯度凝胶电泳（μTGGE）系统被用作快速检测RNA编辑的非测序方法。该过程基于电泳原理，当核酸样品在聚丙烯酰胺凝胶上移动时，该原理使用高温使核酸样品变性。在一定温度范围内，DNA片段形成完全双链DNA到部分分离链的梯度，然后形成完全分离的单链DNA。具有不同核苷酸碱基的RNA编辑位点在μTGGE分析中产生不同的熔解谱。我们使用基于μTGGE的方法表征四个编辑RNA片段的熔解谱与其相应的未编辑（野生型）片段之间的差异。通过比较编辑和未编辑的RNA产生的条带模式来计算模式相似性评分（PaSSs），并用于评估该方法的再现性。总体而言，此处描述的平台能够以直接，简单且经济高效的方式检测RNA中的单个碱基突变。预计该分析工具将有助于新的分子生物学发现。
Introduction
基因组RNA中的单核苷酸变异（SNVs），包括A-to-I，C-to-U和U-to-C变体，可以指示RNA编辑事件。然而，在RNA中检测SNV仍然是一项技术上具有挑战性的任务。传统上，编辑与未编辑的RNA的比例是通过直接测序，等位基因特异性实时聚合酶链反应（PCR）或变性高效液相色谱（HPLC）方法1，2，3，4，5，6来确定的。然而，这些方法并不是特别具有时间或成本效益，并且由高水平噪声引起的低准确性为基于RNA的SNV检测7，8带来了技术瓶颈。在这里，我们描述了一种基于温度梯度凝胶电泳（TGGE）的方案，以鉴定单核苷酸多态性（SNP）作为替代方法，无需直接RNA测序方法进行RNA编辑分析。
电泳是生命科学实验室中分离和分析生物分子的首选方法。TGGE能够分离大小相同但具有不同序列的双链DNA片段。该技术依赖于DNA片段熔化温度的序列相关差异以及随后其在线性温度梯度为9，10的多孔凝胶中迁移率的变化。DNA片段的熔化产生特定的熔解谱。一旦熔融温度最低的结构域在凝胶中的特定位置达到相应的温度，就会发生从螺旋结构到部分熔化结构的转变，分子的迁移实际上将停止。因此，TGGE利用DNA片段的迁移率（尺寸信息）和温度诱导的结构转变（序列依赖性信息），使其成为表征DNA片段的强大方法。TGGE熔化模式中的特征点对应于DNA分子的三个结构转变，它们是链初始解离点，链中间解离点和链末端解离点（图1）。结构域内的序列变化，甚至是单碱基差异，都会影响熔化温度，因此，具有不同序列的分子在TGGE分析中将显示离散的熔化（变性）模式。因此，TGGE可用于分析基因组RNA中的SNV，并且可以成为检测RNA编辑的宝贵高通量方法。当使用传统的基于凝胶电泳的TGGE时，这种高通量增益会丢失。然而，TGGE的小型化版本，称为microTGGE（μTGGE），可用于缩短凝胶电泳时间并加速分析，使生产率提高100倍11。μTGGE方法的简单性和紧凑性通过引入PalmPAGE 12得到了改善，PalmPAGE12是一种现场适用，手持式且价格合理的凝胶电泳系统。
在这里，一种新的基于TGGE的方案用于检查四个基因中的三种类型的RNA编辑位点（A-to-I，C-to-U和U-to-C），包括拟 南 芥组织中的两种和两种在哺乳动物HEK293细胞中表达的RNA编辑位点（图1A）。该协议集成了PalmPAGE（硬件）和uMelt（软件）13的使用，PalmPAGE是一种用于快速检测RNA编辑的便携式系统。该方案的平均运行时间为15-30分钟，可实现快速、可靠和轻松的RNA编辑鉴定，而无需直接的RNA测序方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA编辑在生物学中起着重要作用;然而，目前检测RNA编辑的方法，如色谱和测序，由于其高成本，过多的时间要求和复杂性，提出了一些挑战。这里描述的实验方案是一种简单，快速且经济高效的RNA编辑检测方法，它使用便携式，微型尺寸，基于TGGE的系统。该系统可用于在Sanger测序之前区分编辑和非编辑基因。具体而言，具有单碱基核苷酸修饰的编辑和未编辑基因可以根据TGGE熔解谱的变化进行区?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了日本科学促进会的科学研究补助金（17H02204和18K19288）的支持。Ruchika得到了日本政府的财政支持（文部科学省奖学金）。我们感谢Radhika Biyani女士（JAIST高木实验室）和Kirti Sharma博士（BioSeeds Corporation）在电泳相关实验方面的帮助。
Materials
| 2U ExoI | Takara | 2650A | Exonuclease I |
| 40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1) | Thermo fisher | AM9022 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Thermo Fisher | 17874 | |
| Centrifuge Mini spin | eppendorf | 5452000034 | |
| Digital dry bath/ block heater | Thermo fisher | NA | |
| Gold Taq Polymerase Master mixture | Promega | M7122 | |
| LATaq DNA polymerase | TAKARA | RR002A | Taq Polymerase |
| micro-TGGE cassette holder | BioSeeds Corp. | BS-GE-CH | |
| micro-TGGE apparatus | Lifetech Corp. | TG | |
| micro-TGGE gel cassette | BioSeeds Corp. | BS-TGGE-C | |
| NanoDrop 1000 | Thermo fisher | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Plant Rneasy Mini kit | Qiagen | 74904 | |
| ReverTra Ace Master Mix | TOYOBO | TRT101 | M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | Takara | 2660B | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Thermo fisher | S11494 | |
| TBE buffer | Thermo fisher | B52 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai tesque | 33401-72 | |
| Urea, Nuclease and protease tested | Nacalai tesque | 35940-65 |
References
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