Guérison des plaies cornéennes du poisson-zèbre: de l’abrasion à l’analyse d’imagerie de fermeture de plaie

Summary

Ce protocole se concentre sur l’endommagement de la surface oculaire du poisson-zèbre par abrasion pour évaluer la fermeture ultérieure de la plaie au niveau cellulaire. Cette approche exploite une bavure oculaire pour enlever partiellement l’épithélium cornéen et utilise la microscopie électronique à balayage pour suivre les changements dans la morphologie cellulaire pendant la fermeture de la plaie.

Abstract

En tant que surface transparente de l’œil, la cornée est essentielle à une vision claire. En raison de son emplacement, ce tissu est sujet aux insultes environnementales. En effet, les lésions oculaires les plus fréquemment rencontrées cliniquement sont celles de la cornée. Bien que la cicatrisation des plaies cornéennes ait été largement étudiée chez les petits mammifères (c.-à-d. les souris, les rats et les lapins), les études de physiologie cornéenne ont négligé d’autres espèces, y compris le poisson-zèbre, bien que le poisson-zèbre soit un modèle de recherche classique.

Ce rapport décrit une méthode d’abrasion cornéenne sur le poisson-zèbre. La plaie est réalisée in vivo sur des poissons anesthésiés à l’aide d’une bavure oculaire. Cette méthode permet d’obtenir une plaie épithéliale reproductible, laissant le reste de l’œil intact. Après abrasion, la fermeture de la plaie est surveillée pendant 3 heures, après quoi la plaie est réépithélialisée. En utilisant la microscopie électronique à balayage, suivie du traitement de l’image, la forme des cellules épithéliales et les protubérances apicales peuvent être étudiées pour étudier les différentes étapes de la fermeture de la plaie épithéliale cornéenne.

Les caractéristiques du modèle du poisson-zèbre permettent d’étudier la physiologie du tissu épithélial et le comportement collectif des cellules épithéliales lorsque le tissu est mis à l’épreuve. De plus, l’utilisation d’un modèle privé de l’influence du film lacrymal peut produire de nouvelles réponses concernant la réponse cornéenne au stress. Enfin, ce modèle permet également la délimitation des événements cellulaires et moléculaires impliqués dans tout tissu épithélial soumis à une plaie physique. Cette méthode peut être appliquée à l’évaluation de l’efficacité des médicaments dans les tests précliniques.

Introduction

Comme la plupart des épithéliums sont en contact avec l’environnement extérieur, ils sont sujets aux blessures physiques, ce qui les rend bien adaptés à l’étude des processus de cicatrisation des plaies. Parmi les tissus bien étudiés, la cornée est un modèle extrêmement utile dans l’étude des aspects cellulaires et moléculaires de la cicatrisation des plaies. En tant que surface externe transparente, il fournit une protection physique à l’œil et est le premier élément à concentrer la lumière sur la rétine. Bien que la structure et la composition cellulaire de la rétine diffèrent d’une espèce^{à l’autre}, ces éléments de la cornée sont généralement similaires dans tous les yeux de type caméra, quelle que soit l’espèce.

La cornée est composée de trois couches principales². La première couche et la plus externe est l’épithélium, qui est constamment renouvelé pour assurer sa transparence. La deuxième couche est le stroma, qui contient des cellules dispersées, appelées kératocytes, dans une épaisse couche de fibres de collagène strictement organisées. La troisième couche, la plus interne, est l’endothélium, qui permet la diffusion des nutriments et des liquides de la chambre antérieure vers les couches externes. Les cellules épithéliales et stromales interagissent via des facteurs de croissance et des cytokines³. Cette interaction est mise en évidence par l’apoptose rapide et la prolifération subséquente des kératocytes après une lésion épithéliale ^4,5. En cas de plaie plus profonde, telle qu’une ponction, les kératocytes participent activement au processus de guérison⁶.

Étant en contact avec l’environnement extérieur, les blessures physiques cornéennes sont fréquentes. Beaucoup d’entre eux sont causés par de petits corps étrangers⁷, tels que le sable ou la poussière. Le réflexe de frottement des yeux peut entraîner des abrasions épithéliales étendues et un remodelage cornéen⁸. Selon la taille et la profondeur de la plaie, ces blessures physiques sont douloureuses et prennent plusieurs jours pour guérir⁹. Les caractéristiques optimales de cicatrisation d’un modèle facilitent la compréhension des aspects cellulaires et moléculaires de la fermeture de la plaie. En outre, de tels modèles se sont également révélés utiles pour tester de nouvelles molécules ayant le potentiel d’accélérer la guérison de la cornée, comme démontré précédemment^10,11.

Le protocole décrit ici vise à utiliser le poisson-zèbre comme modèle pertinent pour étudier les lésions physiques cornéennes. Ce modèle est très pratique pour les études de dépistage pharmacologique car il permet d’ajouter des molécules directement à l’eau du réservoir et, par conséquent, d’entrer en contact avec une cornée cicatrisante. Les détails fournis ici aideront les scientifiques à effectuer leurs études sur le modèle du poisson-zèbre. La blessure in vivo est réalisée avec une bavure oculaire émoussée. L’impact sur les cellules épithéliales adjacentes ou éloignées de celui-ci peut être analysé en enlevant spécifiquement l’épithélium cornéen central. Au cours des dernières années, de nombreux rapports se sont concentrés sur une telle méthode sur la cornée de ^{rongeurs 12,13,14,15,16,17}; toutefois, à ce jour, un seul rapport a appliqué cette méthode au poisson-zèbre¹⁸.

En raison de sa simplicité, la plaie physique est utile pour délimiter le rôle des cellules épithéliales dans la fermeture de la plaie. Un autre modèle bien établi de lésion cornéenne est la brûlure chimique, en particulier la brûlure alcaline 19,20,21. Cependant, une telle approche endommage indirectement toute la surface de l’œil, y compris la cornée périphérique et le stroma cornéen¹⁹. En effet, les brûlures alcalines induisent potentiellement des ulcères cornéens, des perforations, une opacification épithéliale et une néovascularisation rapide²², et le résultat incontrôlable des brûlures alcalines disqualifie cette approche pour les études générales de cicatrisation des plaies. De nombreuses autres méthodes sont également utilisées pour étudier la cicatrisation des plaies cornéennes en fonction de l’objectif particulier de l’étude en question (par exemple, le débridement épithélial complet²³, la combinaison de lésions chimiques et mécaniques pour la plaie^{d’épaisseur partielle 24}, l’ablation au laser excimère pour les plaies s’étendant jusqu’au stroma²⁵). L’utilisation d’une bavure oculaire limite le point focal à la réponse épithéliale à la plaie et fournit une plaie hautement reproductible.

Comme pour chaque méthode d’infliction de plaie, l’utilisation d’une bavure oculaire présente des avantages et des inconvénients. Le principal inconvénient est que la réponse étant principalement épithéliale, elle ne reflète pas parfaitement les abrasions observées dans le cadre clinique. Cependant, cette méthode présente de nombreux avantages, notamment la facilité avec laquelle elle peut être mise en place et exécutée, sa précision, sa reproductibilité et le fait qu’elle est non invasive, ce qui en fait une méthode bien tolérée par les animaux.

Protocol

Toutes les expériences ont été approuvées par le conseil national de l’expérimentation animale. 1. Préparatifs Préparer à l’avance la solution mère de tricaïne utilisée pour l’anesthésie26 (solution mère à 0,4 % utilisée dans ce protocole). Utilisez des gants et conservez les matériaux dans une hotte chaque fois que possible. Pour 50 mL d’une solution à 0,4%, peser 200 mg de poudre de tricaïne dans un tube de …

Representative Results

Cette étude décrit une méthode utilisant une bavure ophtalmique dans des expériences de cicatrisation des plaies cornéennes du poisson-zèbre. La méthode est modifiée par rapport à des études antérieures sur des souris, où il a été démontré que la bavure enlevait efficacement les couches de cellules épithéliales13. Les défis de la blessure cornéenne du poisson-zèbre comprennent la taille relativement petite de l’œil et, dans le cas d’expériences fastidieuses, la nécessit…

Discussion

Les blessures physiques cornéennes sont la cause la plus fréquente de visites de patients en ophtalmologie à l’hôpital. Par conséquent, il est important d’établir des modèles pertinents pour l’étude de différents aspects de la physiopathologie cornéenne. Jusqu’à présent, la souris est le modèle le plus couramment utilisé pour l’étude de la cicatrisation des plaies cornéennes. Cependant, l’ajout de gouttes oculaires sur les yeux blessés murins pour valider l’impact de médicaments spécifiqu…

Materials

0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4	in-house		Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).
0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4	in-house		Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).
0.5mm burr tips	Alger Equipment Company	BU-5S
1M Tris, pH 8.8	in-house
adhesive tabs	Agar Scientific	G3347N
Algerbrush burr, Complete instrument	Alger Equipment Company	BR2-5
Cotton swaps	Heinz Herenz Hamburg	1030128
Dissecting plate	in-house
Dissecting tools	Fine Science Tools
double-distilled water	in-house
Eppedorf tubes, 2ml	any provider
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma	A5040	Caution: causes irritation.
Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I	Sigma	G7651	Caution: toxic.
Lidocaine hydrochloride	Sigma	L5647	Caution: toxic.
mounts	Agar Scientific	G301P
Petri dish	Thermo Scientific	101VR20
pH indicator strips	Macherey-Nagel	92110
Plastic spoons	any provider
Plastic tubes, 15 ml	Greiner Bio-One	188271
Plastic tubes, 50 ml	Greiner Bio-One	227261
Scanning electron microscope	FEI	Quanta 250 FEG
Soft sponge	any provider
Sputter coater	Quorum Technologies	GQ150TS
Stereomicroscope	Leica