馴化細胞培養培地から細胞外小胞を分離するためのサイズ排除クロマトグラフィー(英語)
Summary
ここでのプロトコルは、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、細胞外小胞を馴化細胞培養培地から適切に分離できることを示しています。
Abstract
細胞外小胞(EV)は、すべての細胞から放出され、すべての生体液に存在し、それらが由来する親細胞を反映するタンパク質、核酸、および脂質を含むナノサイズの脂質膜結合構造です。サンプル中の他の成分からEVを適切に分離することで、関連する貨物の特性評価が可能になり、多くの疾患の細胞間コミュニケーターおよび非侵襲的バイオマーカーとしての可能性についての洞察が得られます。現在の研究では、希突起膠細胞由来のEVを、限外ろ過やサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)などの最先端技術を組み合わせて細胞培養培地から単離し、EVを他の細胞外タンパク質やタンパク質複合体から分離しました。市販のSECカラムを用いて、コントロールおよび小胞体(ER)ストレス条件下の両方でヒト希突起膠腫細胞から放出された細胞外タンパク質からEVを分離しました。標準的なEVマーカーCD9、CD63、およびCD81は、画分1〜4では観察されましたが、画分5〜8では観察されませんでした。ゴルジ体のタンパク質であるGM130とERの内在性タンパク質であるカルネキシンを陰性のEVマーカーとして使用し、どの画分にも観察されませんでした。また、EV画分として画分1〜4、タンパク質画分として画分5〜8をプール濃縮した場合、EV画分におけるCD63、CD81、およびCD9の発現は認められなかった。GM130またはカルネキシンの発現は、いずれの画分タイプにおいても観察されなかった。対照およびERストレス条件の両方からのプールされた画分を透過型電子顕微鏡で視覚化し、小胞はEV画分で観察されたが、タンパク質画分では観察されなかった。両方の条件からのEVおよびタンパク質画分中の粒子も、ナノ粒子追跡分析で定量化されました。まとめると、これらのデータは、SECが馴化細胞培養培地からEVを分離するための効果的な方法であることを示しています。
Introduction
細胞外小胞(EV)の研究への関心の爆発は、これらのナノサイズの不均一な粒子を分離して研究するために使用される技術と技術の大きな進歩を伴っています。約40年前の発見以来1,2、これらの小さな膜構造は生理活性脂質、核酸、タンパク質を含み、細胞間コミュニケーションにおいて主要な役割を果たしていることがわかっています3,4。EVはすべての細胞型から放出されるため、血漿や血清、唾液、尿など、すべての体液に存在します。これらの液体中のEVは、神経炎症性疾患や神経変性疾患、癌、自己免疫疾患など、さまざまな疾患の非侵襲的バイオマーカーとして機能することが大いに期待されています5,6,7。さらに、インビトロ機構研究は、培養培地3、8、9に放出されたEVを分離することによって細胞培養技術を通じて行うことができる。
疾患の病態生理におけるEVの役割を理解するには、EVが見つかった液体から適切に分離することが最も重要です。EV分離のゴールドスタンダードは長い間示差超遠心(dUC)10でしたが、EVを他の細胞外成分からよりよく分離するために、より洗練された技術が生まれています。これらの手法には、密度勾配、非対称フローフィールドフローフラクション(A4F)、フローサイトメトリー、イムノキャプチャー、ポリエチレングリコール沈殿、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)などがあります11,12,13。各手法には、独自の長所と短所があります。しかし、特にSECは、生体液と細胞培養上清の両方からEVを非常に効果的に分離することが示されています8,14,15。SECには、比較的簡単でユーザーフレンドリーであるという追加のボーナスもあります。
SECは、サイズに基づいて流体の成分を分離する方法です。この技術では、樹脂のカラム(社内で製造されたもの、または市販品で購入されたもの)を使用してサンプルを分画します。サンプル中の小さな粒子は樹脂内のビーズの間に閉じ込められますが、大きな粒子は樹脂をより自由に通過できるため、プロセスの早い段階で溶出します。EVは多くの細胞外タンパク質やタンパク質凝集体よりもサイズが大きいため、EVは細胞外タンパク質よりも速くカラムを通過し、早い画分で溶出します14。
この方法の論文では、コントロールおよび小胞体(ER)ストレス条件の両方の下で、ヒト希突起膠細胞から細胞培養培地(CCM)からEVを分離するためのSECの使用について概説しています。このプロトコルを使用すると、この手法で分離されたEVは、一緒にプールして下流の特性評価のために濃縮できる特定の画分内に見られ、分離されたEVは細胞に由来し、CCMを補完するために使用されるウシ胎児血清(FBS)などの外因性源からではないことが示されています。EV画分における標準的なEVマーカーCD63、CD81、およびCD916、17、18、19の存在、およびタンパク質画分におけるそれらの不在は、ウェスタンブロッティングで実証されています。透過型電子顕微鏡(TEM)を使用して、EVは視覚化され、期待される形態を示し、EV分画でのみ観察されます。粒子は、対照およびERストレス条件の両方のEVおよびタンパク質画分でもカウントされ、EVサンプルでは直径50〜200nmの予想されるサイズ範囲内の多数の粒子が観察されます。これらのデータを組み合わせることで、SECが細胞培養培地からEVを分離するための効率的かつ効果的な方法であるという考えが裏付けられています。
Protocol
Representative Results
Discussion
SECは、EVをコンディショニングCCMから適切に分離するためのユーザーフレンドリーな方法です。細胞由来EVを特異的に分離するためには、CCMの種類とそのサプリメントを慎重に検討する必要があります。多くの細胞培養培地には、血清を採取した動物由来のEVを含むFBSを補充する必要があります。これらの血清EVは、培養中の細胞に由来するEVによって産生される任意のシグナルを飽和させ、マ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ペンシルベニア州立大学ベーレンドとハモット健康財団の資金提供、およびペンシルバニア州ユニバーシティパークのペンシルベニア州立大学顕微鏡施設に感謝したいと思います。
Materials
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 97064-588 | |
| 4X Laemmli Sample Buffer | BioRad | 1610747 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, Ultracel, 3 KDa, 15mL | Sigma-Aldrich | UFC900308 | 3 kDa cutoff |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane | Sigma-Aldrich | UFC200324 | 3 kDa cutoff |
| Ammonium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678-100G | |
| Anti rabbit IgG, HRP linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074V | 1:1000 Dilution |
| Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab22595 | 1:500 Dilution |
| Anti-CD9 Mouse Monoclonal Antibody | BioLegend | 312102 | 1:500 Dilution |
| Anti-GM130 antibody [EP892Y] – cis-Golgi Marker | Abcam | ab52649 | 1:500 Dilution |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076V | 1:1000 Dilution |
| Automatic Fraction Collector | Izon Science | ||
| BCA assay Kit | Bio-Rad | ||
| CCD camera | Gatan Orius SC200 | ||
| Cd63 Mouse anti Human | BD | 556019 | 1:1000 Dilution |
| CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-23962 | 1:1000 Dilution |
| Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks | Greiner Bio-One | 660175 | |
| ChemiDoc MP Imager | BioRad | ||
| Clarity Western ECL Substrate | BioRad | 1705061 | |
| deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-10G | |
| dithiothreitol | Sigma | 3483-12-3 | |
| DMEM/High glucose with L-glutamine; without sodium | Cytiva | SH300022.FS | |
| Fetal Bovine Serum Premium grade | VWR | 97068-085 | |
| Fetal Bovine Serum, exosome-depleted | Thermo Scientific | A2720801 | |
| Glycine | BioRad | 1610718 | |
| Great Value Nonfat Dry Milk | Amazon | B076NRD2TZ | |
| HOG Human Oligodendroglioma Cell Line | Sigma-Aldrich | SCC163 | |
| Izon Science Usa Ltd qev Size Exclusion Columns 5pk | Izon Science | ||
| Methanol >99.8% ACS | VWR | BDH1135-4LP | |
| Mini-PROTEAN Glass plates | BioRad | 1653310 | with 0.75mm spacers |
| Mini-PROTEAN Short plates | BioRad | 1653308 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | 492016 | |
| Penicillin-Streptomycin,Solution | Sigma-Aldrich | P4458-100mL | |
| Phosphate Buffered Saline PBS | Fisher Scientific | BP66150 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kits and Reagents | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Pierce PVDF Transfer Membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Pierce Western Blotting Filter Paper | Thermo Scientific | 84783 | |
| Polyoxyethylene-20 (TWEEN 20), 500mL | Bio Basic | TB0560 | |
| Protease/phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Cell Signaling Technology | 5872S | |
| Recombinant Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)] | ABCam | ab125011 | 1:1000 dilution |
| Slodium hydroxide | Sigma-Aldrich | SX0603 | |
| Sodium azide | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
| Sodium dodecyl sulfate,≥99.0% (GC), dust-free pellets | Sigma-Aldrich | 75746-1KG | |
| Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281-25ML | |
| TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10% | BioRad | 1610183 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI Tecnai 12 Biotwin | ||
| Tris | BioRad | 1610716 | |
| Trypsin 0.25% protease with porcine trypsin, HBSS, EDTA; without calcium, magnesium | Cytiva | SH30042.01 | |
| Tunicamycin | Tocris | 3516 | |
| Zeta View software | Analytik | NTA software |
References
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