Chromatographie d’exclusion de taille pour séparer les vésicules extracellulaires des milieux de culture cellulaire conditionnés
Summary
Le protocole démontre ici que les vésicules extracellulaires peuvent être séparées de manière adéquate des milieux de culture cellulaire conditionnés en utilisant la chromatographie d’exclusion de taille.
Abstract
Les vésicules extracellulaires (VE) sont des structures liées à la membrane lipidique de taille nanométrique qui sont libérées par toutes les cellules, sont présentes dans tous les biofluides et contiennent des protéines, des acides nucléiques et des lipides qui reflètent la cellule mère dont elles sont dérivées. La séparation appropriée des véhicules électriques des autres composants d’un échantillon permet de caractériser leur cargaison associée et donne un aperçu de leur potentiel en tant que communicateurs intercellulaires et biomarqueurs non invasifs pour de nombreuses maladies. Dans la présente étude, des VE dérivés d’oligodendrocytes ont été isolés à partir de milieux de culture cellulaire à l’aide d’une combinaison de techniques de pointe, y compris l’ultrafiltration et la chromatographie d’exclusion de taille (SEC) pour séparer les VE des autres protéines extracellulaires et complexes protéiques. À l’aide de colonnes SEC disponibles dans le commerce, les VE ont été séparés des protéines extracellulaires libérées par les cellules d’oligodendrogliome humain dans des conditions de stress de contrôle et de réticulum endoplasmique (RE). Les marqueurs EV canoniques CD9, CD63 et CD81 ont été observés dans les fractions 1-4, mais pas dans les fractions 5-8. GM130, une protéine de l’appareil de Golgi, et la calnexine, une protéine intégrale du RE, ont été utilisés comme marqueurs EV négatifs, et n’ont été observés dans aucune fraction. De plus, en regroupant et en concentrant les fractions 1 à 4 en tant que fraction EV et les fractions 5 à 8 en tant que fraction protéique, l’expression de CD63, CD81 et CD9 dans la fraction EV a été observée. L’expression de GM130 ou de calnexine n’a été observée dans aucun des types de fraction. Les fractions regroupées des conditions de contrôle et de stress ER ont été visualisées par microscopie électronique à transmission et des vésicules ont été observées dans les fractions EV, mais pas dans les fractions protéiques. Les particules dans l’EV et les fractions protéiques des deux conditions ont également été quantifiées avec une analyse de suivi des nanoparticules. Ensemble, ces données démontrent que la SEC est une méthode efficace pour séparer les VE des milieux de culture cellulaire conditionnés.
Introduction
L’explosion de l’intérêt pour l’étude des vésicules extracellulaires (VE) s’est accompagnée de progrès majeurs dans les technologies et les techniques utilisées pour séparer et étudier ces particules hétérogènes de taille nanométrique. Depuis leur découverte il y a près de quatre décennies1,2, ces petites structures membraneuses contiennent des lipides, des acides nucléiques et des protéines bioactifs et jouent un rôle majeur dans la communication intercellulaire 3,4. Les VE sont libérés par tous les types de cellules et sont donc présents dans tous les liquides biologiques, y compris le plasma sanguin et le sérum, la salive et l’urine. Les VE dans ces fluides sont très prometteurs pour servir de biomarqueurs non invasifs pour diverses maladies, y compris les maladies neuroinflammatoires et neurodégénératives, les cancers et les maladies auto-immunes 5,6,7. De plus, des études mécanistes in vitro peuvent être réalisées au moyen de techniques de culture cellulaire en séparant les VE libérés dans le milieu de culture 3,8,9.
Pour comprendre le rôle des VE dans la physiopathologie de la maladie, une séparation adéquate du liquide dans lequel ils se trouvent est primordiale. L’étalon-or pour la séparation des véhicules électriques a longtemps été l’ultracentrifugation différentielle (dUC)10, mais des techniques plus sophistiquées ont vu le jour pour obtenir une meilleure séparation des véhicules électriques des autres composants extracellulaires. Certaines de ces techniques comprennent les gradients de densité, la fraction d’écoulement en champ à flux asymétrique (A4F), la cytométrie en flux, l’immunocapture, la précipitation au polyéthylèneglycol et la chromatographie d’exclusion de taille (SEC)11,12,13. Chaque technique a son propre ensemble d’avantages et d’inconvénients; cependant, il a été démontré que la SEC en particulier sépare assez efficacement les VE des fluides biologiques et des surnageants de culture cellulaire 8,14,15. SEC a également l’avantage supplémentaire d’être relativement simple et convivial.
La SEC est une méthode qui sépare les composants d’un fluide en fonction de leur taille. Avec cette technique, une colonne de résine (fabriquée en interne ou achetée dans le commerce) est utilisée pour fractionner un échantillon. Les petites particules dans l’échantillon sont piégées entre les billes dans la résine, tandis que les particules plus grosses sont capables de passer à travers la résine plus librement, et donc éluer plus tôt dans le processus. Parce que les VE sont plus grands en taille que de nombreuses protéines extracellulaires et agrégats de protéines, les VE traversent la colonne plus rapidement et éluent dans des fractions plus précoces que les protéines extracellulaires14.
Dans cet article sur les méthodes, l’utilisation de la SEC pour la séparation des VE des milieux de culture cellulaire (CCM) des oligodendrocytes humains dans des conditions de contrôle et de stress du réticulum endoplasmique (RE) est décrite. À l’aide de ce protocole, il est démontré que les VE séparés par cette technique se trouvent dans des fractions spécifiques qui peuvent être regroupées et concentrées pour la caractérisation en aval, et que les VE séparés sont dérivés de cellules et non d’une source exogène telle que le sérum bovin fœtal (FBS) utilisé pour compléter la CCM. La présence des marqueurs EV canoniques, CD63, CD81 et CD916,17,18,19 dans les fractions EV, et leur absence dans les fractions protéiques est démontrée par le Western blotting. En utilisant la microscopie électronique à transmission (MET), les VE sont visualisés et affichent la morphologie attendue et ne sont observés que dans la fraction EV. Les particules sont également comptées dans les fractions EV et protéique des conditions de contrainte témoin et ER, et un grand nombre de particules dans la plage de taille prévue de 50 à 200 nm de diamètre sont observées dans les échantillons EV. Ensemble, ces données appuient l’idée que la SEC est une méthode efficiente et efficace pour séparer les VE des milieux de culture cellulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
SEC est une méthode conviviale pour séparer adéquatement les véhicules électriques des CCM conditionnés. Afin d’isoler spécifiquement les VE dérivés de cellules, il faut tenir compte d’un examen attentif du type de CCM et de ses suppléments. De nombreux milieux de culture cellulaire doivent être complétés par du FBS, qui contient des VE dérivés de l’animal chez lequel le sérum a été récolté. Ces VE sériques peuvent saturer et masquer tout signal produit par les VE dérivés de cellules en cultu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Penn State Behrend et la Hamot Health Foundation pour leur financement, ainsi que le Penn State Microscopy Facility à University Park, en Pennsylvanie.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 97064-588 | |
| 4X Laemmli Sample Buffer | BioRad | 1610747 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, Ultracel, 3 KDa, 15mL | Sigma-Aldrich | UFC900308 | 3 kDa cutoff |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane | Sigma-Aldrich | UFC200324 | 3 kDa cutoff |
| Ammonium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678-100G | |
| Anti rabbit IgG, HRP linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074V | 1:1000 Dilution |
| Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab22595 | 1:500 Dilution |
| Anti-CD9 Mouse Monoclonal Antibody | BioLegend | 312102 | 1:500 Dilution |
| Anti-GM130 antibody [EP892Y] – cis-Golgi Marker | Abcam | ab52649 | 1:500 Dilution |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076V | 1:1000 Dilution |
| Automatic Fraction Collector | Izon Science | ||
| BCA assay Kit | Bio-Rad | ||
| CCD camera | Gatan Orius SC200 | ||
| Cd63 Mouse anti Human | BD | 556019 | 1:1000 Dilution |
| CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-23962 | 1:1000 Dilution |
| Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks | Greiner Bio-One | 660175 | |
| ChemiDoc MP Imager | BioRad | ||
| Clarity Western ECL Substrate | BioRad | 1705061 | |
| deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-10G | |
| dithiothreitol | Sigma | 3483-12-3 | |
| DMEM/High glucose with L-glutamine; without sodium | Cytiva | SH300022.FS | |
| Fetal Bovine Serum Premium grade | VWR | 97068-085 | |
| Fetal Bovine Serum, exosome-depleted | Thermo Scientific | A2720801 | |
| Glycine | BioRad | 1610718 | |
| Great Value Nonfat Dry Milk | Amazon | B076NRD2TZ | |
| HOG Human Oligodendroglioma Cell Line | Sigma-Aldrich | SCC163 | |
| Izon Science Usa Ltd qev Size Exclusion Columns 5pk | Izon Science | ||
| Methanol >99.8% ACS | VWR | BDH1135-4LP | |
| Mini-PROTEAN Glass plates | BioRad | 1653310 | with 0.75mm spacers |
| Mini-PROTEAN Short plates | BioRad | 1653308 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | 492016 | |
| Penicillin-Streptomycin,Solution | Sigma-Aldrich | P4458-100mL | |
| Phosphate Buffered Saline PBS | Fisher Scientific | BP66150 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kits and Reagents | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Pierce PVDF Transfer Membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Pierce Western Blotting Filter Paper | Thermo Scientific | 84783 | |
| Polyoxyethylene-20 (TWEEN 20), 500mL | Bio Basic | TB0560 | |
| Protease/phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Cell Signaling Technology | 5872S | |
| Recombinant Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)] | ABCam | ab125011 | 1:1000 dilution |
| Slodium hydroxide | Sigma-Aldrich | SX0603 | |
| Sodium azide | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
| Sodium dodecyl sulfate,≥99.0% (GC), dust-free pellets | Sigma-Aldrich | 75746-1KG | |
| Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281-25ML | |
| TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10% | BioRad | 1610183 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI Tecnai 12 Biotwin | ||
| Tris | BioRad | 1610716 | |
| Trypsin 0.25% protease with porcine trypsin, HBSS, EDTA; without calcium, magnesium | Cytiva | SH30042.01 | |
| Tunicamycin | Tocris | 3516 | |
| Zeta View software | Analytik | NTA software |
References
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