यहां प्रोटोकॉल दर्शाता है कि आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके बाह्य पुटिकाओं को वातानुकूलित सेल कल्चर मीडिया से पर्याप्त रूप से अलग किया जा सकता है।
एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (ईवी) नैनो-आकार के लिपिड-झिल्ली बाध्य संरचनाएं हैं जो सभी कोशिकाओं से जारी की जाती हैं, सभी बायोफ्लुइड्स में मौजूद होती हैं, और इसमें प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड और लिपिड होते हैं जो मूल कोशिका के प्रतिबिंबित होते हैं जिनसे वे प्राप्त होते हैं। एक नमूने में अन्य घटकों से ईवी का उचित पृथक्करण उनके संबंधित कार्गो के लक्षण वर्णन की अनुमति देता है और कई बीमारियों के लिए इंटरसेलुलर संचारकों और गैर-इनवेसिव बायोमार्कर के रूप में उनकी क्षमता में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। वर्तमान अध्ययन में, ऑलिगोडेंड्रोसाइट व्युत्पन्न ईवी को अत्याधुनिक तकनीकों के संयोजन का उपयोग करके सेल कल्चर मीडिया से अलग किया गया था, जिसमें अल्ट्राफिल्ट्रेशन और आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) शामिल हैं ताकि ईवी को अन्य बाह्य प्रोटीन और प्रोटीन कॉम्प्लेक्स से अलग किया जा सके। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एसईसी कॉलम का उपयोग करते हुए, ईवी को नियंत्रण और एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) तनाव स्थितियों दोनों के तहत मानव ऑलिगोडेंड्रोग्लिओमा कोशिकाओं से जारी बाह्य प्रोटीन से अलग किया गया था। कैननिकल ईवी मार्कर सीडी 9, सीडी 63, और सीडी 81 को अंश 1-4 में देखा गया था, लेकिन अंश 5-8 में नहीं। जीएम 130, गोल्गी तंत्र का एक प्रोटीन, और कैलनेक्सिन, ईआर का एक अभिन्न प्रोटीन, नकारात्मक ईवी मार्करों के रूप में उपयोग किया गया था, और किसी भी अंश में नहीं देखा गया था। इसके अलावा, जब ईवी अंश के रूप में अंश 1-4 और प्रोटीन अंश के रूप में अंश 5-8 को पूलिंग और केंद्रित किया जाता है, तो ईवी अंश में सीडी 63, सीडी 81 और सीडी 9 की अभिव्यक्ति देखी गई थी। जीएम 130 या कैलनेक्सिन की अभिव्यक्ति किसी भी अंश प्रकार में नहीं देखी गई थी। नियंत्रण और ईआर तनाव दोनों स्थितियों से पूल किए गए अंशों को ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ देखा गया था और ईवी अंशों में पुटिकाओं को देखा गया था, लेकिन प्रोटीन अंशों में नहीं। दोनों स्थितियों से ईवी और प्रोटीन अंशों में कणों को भी नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण के साथ परिमाणित किया गया था। साथ में, इन आंकड़ों से पता चलता है कि एसईसी वातानुकूलित सेल संस्कृति मीडिया से ईवी को अलग करने के लिए एक प्रभावी तरीका है।
बाह्य पुटिकाओं (ईवी) का अध्ययन करने में रुचि का विस्फोट इन नैनो-आकार, विषम कणों को अलग करने और अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रौद्योगिकियों और तकनीकों में प्रमुख प्रगति के साथ हुआ है। लगभग चार दशक पहले 1,2 से उनकी खोज के बाद से, इन छोटे झिल्लीदार संरचनाओं में बायोएक्टिव लिपिड, न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन पाए गए हैं, और अंतरकोशिकीय संचार 3,4 में प्रमुख भूमिका निभाते हैं। ईवी सभी सेल प्रकारों से जारी किए जाते हैं और इसलिए रक्त प्लाज्मा और सीरम, लार और मूत्र सहित सभी जैविक तरल पदार्थों में मौजूद होते हैं। इन तरल पदार्थों के भीतर ईवी विभिन्न बीमारियों के लिए गैर-इनवेसिव बायोमाकर्स के रूप में काम करने का बहुत वादा करते हैं, जिसमें न्यूरोइन्फ्लेमेटरी और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग, कैंसर और ऑटोइम्यून विकार 5,6,7 शामिल हैं। इसके अलावा, इन विट्रो यांत्रिक अध्ययनों को संस्कृति माध्यम 3,8,9 में जारी ईवी को अलग करके सेल कल्चर तकनीकों के माध्यम से किया जा सकता है।
रोग पैथोफिज़ियोलॉजी में ईवी की भूमिका को समझने के लिए, तरल पदार्थ से पर्याप्त पृथक्करण जिसमें वे पाए जाते हैं, सर्वोपरि है। ईवी पृथक्करण के लिए स्वर्ण मानक लंबे समय से अंतर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन (डीयूसी) 10 रहा है, हालांकि अन्य बाह्य घटकों से ईवी के बेहतर पृथक्करण को प्राप्त करने के लिए अधिक परिष्कृत तकनीकें उत्पन्न हुई हैं। इनमें से कुछ तकनीकों में घनत्व ग्रेडिएंट, विषम-प्रवाह क्षेत्र-प्रवाह अंश (ए 4 एफ), फ्लो साइटोमेट्री, इम्यूनोकैप्चर, पॉलीथीन ग्लाइकोल वर्षा, और आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) 11,12,13 शामिल हैं। प्रत्येक तकनीक के फायदे और नुकसान का अपना सेट है; हालांकि, एसईसी को विशेष रूप से जैविक तरल पदार्थ और सेल कल्चर सुपरनैटेंट दोनों से ईवी को अलग करने के लिए दिखाया गया है। एसईसी के पास अपेक्षाकृत सरल और उपयोगकर्ता के अनुकूल होने का अतिरिक्त बोनस भी है।
एसईसी एक विधि है जो आकार के आधार पर तरल पदार्थ के घटकों को अलग करती है। इस तकनीक के साथ, राल का एक स्तंभ (या तो घर में बनाया जाता है या व्यावसायिक रूप से खरीदा जाता है) का उपयोग नमूने को अलग करने के लिए किया जाता है। नमूने में छोटे कण राल के भीतर मोतियों के बीच फंस जाते हैं, जबकि बड़े कण राल के माध्यम से अधिक स्वतंत्र रूप से पारित करने में सक्षम होते हैं, और इस प्रकार प्रक्रिया में पहले होते हैं। चूंकि ईवी कई बाह्य प्रोटीन और प्रोटीन समुच्चय की तुलना में आकार में बड़े होते हैं, ईवी बाह्य प्रोटीन14 की तुलना में पहले के अंशों में स्तंभ से तेजी से गुजरते हैं।
इस विधि पत्र में, नियंत्रण और एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) तनाव स्थितियों दोनों के तहत मानव ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स से सेल कल्चर मीडिया (सीसीएम) से ईवी को अलग करने के लिए एसईसी के उपयोग को रेखांकित किया गया है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, यह दिखाया गया है कि इस तकनीक के साथ अलग किए गए ईवी विशिष्ट अंशों के भीतर पाए जाते हैं जिन्हें एक साथ पूल किया जा सकता है और डाउनस्ट्रीम लक्षण वर्णन के लिए केंद्रित किया जा सकता है, और यह कि अलग ईवी कोशिकाओं से प्राप्त होते हैं, न कि भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) जैसे बहिर्जात स्रोत से जिसका उपयोग सीसीएम के पूरक के लिए किया जाता है। ईवी अंशों में कैननिकल ईवी मार्कर, सीडी 63, सीडी 81, और सीडी 9 16,17,18,19 की उपस्थिति, और प्रोटीन अंशों में उनकी अनुपस्थिति पश्चिमी सोख्ता के साथ प्रदर्शित होती है। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) का उपयोग करके, ईवी को कल्पना की जाती है और अपेक्षित आकृति विज्ञान प्रदर्शित किया जाता है और केवल ईवी अंश में देखा जाता है। कणों को नियंत्रण और ईआर तनाव स्थितियों दोनों के ईवी और प्रोटीन अंशों में भी गिना जाता है, और ईवी नमूनों में व्यास में 50-200 एनएम की अपेक्षित आकार सीमा के भीतर बड़ी संख्या में कण देखे जाते हैं। साथ में, ये डेटा इस धारणा का समर्थन करते हैं कि एसईसी सेल कल्चर मीडिया से ईवी को अलग करने के लिए एक कुशल और प्रभावी तरीका है।
एसईसी वातानुकूलित सीसीएम से ईवी को पर्याप्त रूप से अलग करने के लिए एक उपयोगकर्ता के अनुकूल तरीका है। विशेष रूप से सेल व्युत्पन्न ईवी को अलग करने के लिए, सीसीएम के प्रकार और इसके पूरक पर सावधानीपूर्वक व?…
The authors have nothing to disclose.
लेखक फंडिंग के लिए पेन स्टेट बेहरेंड और हैमोट हेल्थ फाउंडेशन को धन्यवाद देना चाहते हैं, साथ ही यूनिवर्सिटी पार्क, पीए में पेन स्टेट माइक्रोस्कोपी सुविधा भी।
2-Mercaptoethanol | VWR | 97064-588 | |
4X Laemmli Sample Buffer | BioRad | 1610747 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, Ultracel, 3 KDa, 15mL | Sigma-Aldrich | UFC900308 | 3 kDa cutoff |
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane | Sigma-Aldrich | UFC200324 | 3 kDa cutoff |
Ammonium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678-100G | |
Anti rabbit IgG, HRP linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074V | 1:1000 Dilution |
Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab22595 | 1:500 Dilution |
Anti-CD9 Mouse Monoclonal Antibody | BioLegend | 312102 | 1:500 Dilution |
Anti-GM130 antibody [EP892Y] – cis-Golgi Marker | Abcam | ab52649 | 1:500 Dilution |
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076V | 1:1000 Dilution |
Automatic Fraction Collector | Izon Science | ||
BCA assay Kit | Bio-Rad | ||
CCD camera | Gatan Orius SC200 | ||
Cd63 Mouse anti Human | BD | 556019 | 1:1000 Dilution |
CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-23962 | 1:1000 Dilution |
Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks | Greiner Bio-One | 660175 | |
ChemiDoc MP Imager | BioRad | ||
Clarity Western ECL Substrate | BioRad | 1705061 | |
deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-10G | |
dithiothreitol | Sigma | 3483-12-3 | |
DMEM/High glucose with L-glutamine; without sodium | Cytiva | SH300022.FS | |
Fetal Bovine Serum Premium grade | VWR | 97068-085 | |
Fetal Bovine Serum, exosome-depleted | Thermo Scientific | A2720801 | |
Glycine | BioRad | 1610718 | |
Great Value Nonfat Dry Milk | Amazon | B076NRD2TZ | |
HOG Human Oligodendroglioma Cell Line | Sigma-Aldrich | SCC163 | |
Izon Science Usa Ltd qev Size Exclusion Columns 5pk | Izon Science | ||
Methanol >99.8% ACS | VWR | BDH1135-4LP | |
Mini-PROTEAN Glass plates | BioRad | 1653310 | with 0.75mm spacers |
Mini-PROTEAN Short plates | BioRad | 1653308 | |
NP-40 | Sigma-Aldrich | 492016 | |
Penicillin-Streptomycin,Solution | Sigma-Aldrich | P4458-100mL | |
Phosphate Buffered Saline PBS | Fisher Scientific | BP66150 | |
Pierce BCA Protein Assay Kits and Reagents | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
Pierce PVDF Transfer Membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
Pierce Western Blotting Filter Paper | Thermo Scientific | 84783 | |
Polyoxyethylene-20 (TWEEN 20), 500mL | Bio Basic | TB0560 | |
Protease/phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Cell Signaling Technology | 5872S | |
Recombinant Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)] | ABCam | ab125011 | 1:1000 dilution |
Slodium hydroxide | Sigma-Aldrich | SX0603 | |
Sodium azide | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
Sodium dodecyl sulfate,≥99.0% (GC), dust-free pellets | Sigma-Aldrich | 75746-1KG | |
Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281-25ML | |
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10% | BioRad | 1610183 | |
Transmission Electron Microscope | FEI Tecnai 12 Biotwin | ||
Tris | BioRad | 1610716 | |
Trypsin 0.25% protease with porcine trypsin, HBSS, EDTA; without calcium, magnesium | Cytiva | SH30042.01 | |
Tunicamycin | Tocris | 3516 | |
Zeta View software | Analytik | NTA software |