Analyse quantitative des propriétés viscoélastiques des globules rouges à l’aide de pinces optiques et de microscopie à défocalisation
Summary
Ici, un protocole intégré basé sur des pinces optiques et une microscopie de défocalisation est décrit pour mesurer les propriétés rhéologiques des cellules. Ce protocole a une large applicabilité dans l’étude des propriétés viscoélastiques des érythrocytes dans des conditions physiopathologiques variables.
Abstract
Les propriétés viscoélastiques des érythrocytes ont été étudiées par une gamme de techniques. Cependant, les données expérimentales rapportées varient. Ceci n’est pas seulement attribué à la variabilité normale des cellules, mais aussi aux différences dans les méthodes et les modèles de réponse cellulaire. Ici, un protocole intégré utilisant des pinces optiques et une microscopie défocalisante est utilisé pour obtenir les caractéristiques rhéologiques des globules rouges dans la gamme de fréquences de 1 Hz à 35 Hz. Alors que des pincettes optiques sont utilisées pour mesurer la constante élastique du complexe érythrocytaire, la microscopie de défocalisation est capable d’obtenir le profil de hauteur de la cellule, le volume et son facteur de forme, un paramètre qui permet la conversion de la constante élastique complexe en module de cisaillement complexe. De plus, en appliquant un modèle de rhéologie vitreuse douce, l’exposant de mise à l’échelle pour les deux modules peut être obtenu. La méthodologie développée permet d’explorer le comportement mécanique des globules rouges, en caractérisant leurs paramètres viscoélastiques, obtenus dans des conditions expérimentales bien définies, pour plusieurs conditions physiologiques et pathologiques.
Introduction
Les globules rouges matures (GR), également appelés érythrocytes, sont capables de s’étendre plus de deux fois leur taille lorsqu’ils traversent les capillaires les plus étroits du corps humain1. Cette capacité est attribuée à leur capacité unique à se déformer lorsqu’ils sont soumis à des charges externes.
Au cours des dernières années, différentes études ont caractérisé cette caractéristique dans les surfaces de globules rouges 2,3. Le domaine de la physique qui décrit les réponses élastiques et visqueuses des matériaux dues aux charges externes est appelé rhéologie. En général, lorsqu’une force externe est appliquée, la déformation résultante dépend des propriétés du matériau et peut être divisée en déformations élastiques, qui stockent de l’énergie, ou déformations visqueuses, qui dissipent l’énergie4. Toutes les cellules, y compris les globules rouges, présentent un comportement viscoélastique; En d’autres termes, l’énergie est à la fois stockée et dissipée. La réponse viscoélastique d’une cellule peut ainsi être caractérisée par son module de cisaillement complexe G*(ω) = G'(ω) + iG”(ω), où G‘(ω) est le module de stockage, lié au comportement élastique, et G » (ω) est le module de perte, lié à sa viscosité4. De plus, des modèles phénoménologiques ont été utilisés pour décrire les réponses cellulaires, l’un des plus utilisés est appelé le modèle de rhéologie vitreusedouce 5, caractérisé par une dépendance de la loi de puissance du module de cisaillement complexe avec la fréquence de charge.
Des méthodes à cellule unique ont été utilisées pour caractériser les propriétés viscoélastiques des globules rouges, en appliquant une force et en mesurant le déplacement en fonction de la charge imposée 2,3. Cependant, pour le module de cisaillement complexe, peu de résultats peuvent être trouvés dans la littérature. En utilisant la diffusion dynamique de la lumière, les valeurs des modules de stockage et de perte de globules rouges ont été rapportées variant de 0,01 à 1 Pa, dans la gamme de fréquences de 1 à 100 Hz6. En utilisant la cytométrie optique de torsion magnétique, un module d’élasticité complexe apparent a été obtenu7, et à des fins de comparaison, un facteur multiplicatif a été revendiqué pour éventuellement clarifier les écarts.
Plus récemment, une nouvelle méthodologie basée sur les pinces optiques (OT) ainsi que la microscopie de défocalisation (DM), en tant qu’outil intégré pour cartographier quantitativement le stockage et la perte des modules de cisaillement des érythrocytes humains sur des charges dépendantes du temps, a été établie 8,9. De plus, un modèle de rhéologie vitreuse souple a été utilisé pour ajuster les résultats et obtenir un coefficient de loi de puissance qui caractérise les globules rouges 8,9.
Dans l’ensemble, la méthodologie développée8,9, dont le protocole est décrit en détail ci-dessous, clarifie les divergences précédentes en utilisant les valeurs mesurées pour le facteur de forme, Ff, qui relie les forces et les déformations aux contraintes et aux déformations dans la surface des globules rouges et peut être utilisée comme nouvelle méthode de diagnostic capable de déterminer quantitativement les paramètres viscoélastiques et les caractéristiques vitreuses molles des globules rouges obtenus à partir de personnes ayant du sang différent. Pathologies. Une telle caractérisation, à l’aide du protocole décrit ci-dessous, peut ouvrir de nouvelles possibilités pour comprendre le comportement des globules rouges d’un point de vue mécanobiologique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, une méthode intégrée basée sur des pinces optiques et une microscopie à défocalisation est présentée pour cartographier quantitativement les propriétés viscoélastiques des globules rouges. Les résultats pour les modules de cisaillement de stockage et de perte, ainsi que l’exposant de mise à l’échelle qui caractérise la rhéologie vitreuse molle des globules rouges sont déterminés. L’application de ce protocole pour différentes conditions expérimentales, telles que dans la situa…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier tous les membres de l’installation de microscopie avancée CENABIO pour leur aide précieuse. Ce travail a été soutenu par les agences brésiliennes Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – Code financier 001, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) et Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fluidos Complexos (INCT-FCx) ainsi que Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). B.P. a été soutenu par une subvention JCNE de FAPERJ.
Materials
| 35mm culture dishes | Corning | 430165 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Coverslips | Knittel Glass | VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek Life Sciences | P35G-0-10-C | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Immersion oil | Nikon | MXA22165 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE300 | |
| KaleidaGraph | Synergy Software | https://www.synergy.com/ | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Microscope camera | Hamamatsu | C11440-10C | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neubauer chamber | Sigma-Aldrich | BR717805-1EA | |
| Objective lens | Nikon | PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2 | |
| Optical table | Thorlabs | T1020CK | |
| OT laser | IPG Photonics | YLR-5-1064-LP | |
| Polystyrene microspheres | Polysciences | 17134-15 | |
| rubber ring | Forever Seals | NBR O-Ring | |
| Silicone grease | Dow Corning | Z273554 | |
| Stage positioning | PI | P-545.3R8S | |
| Pipette | Gilson | P1000 |
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