Kırmızı Kan Hücrelerinin Viskoelastik Özelliklerinin Optik Cımbız ve Bulanıklaştırma Mikroskobu Kullanılarak Kantitatif Analizi
Summary
Burada, hücrelerin reolojik özelliklerini ölçmek için optik cımbız ve defokus mikroskobuna dayanan entegre bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokol, değişken fizyo-patolojik koşullar altında eritrositlerin viskoelastik özelliklerinin incelenmesinde geniş uygulanabilirliğe sahiptir.
Abstract
Eritrositlerin viskoelastik özellikleri bir dizi teknikle araştırılmıştır. Bununla birlikte, bildirilen deneysel veriler farklılık göstermektedir. Bu sadece hücrelerin normal değişkenliğine değil, aynı zamanda hücre yanıtının yöntem ve modellerindeki farklılıklara da atfedilir. Burada, 1 Hz ila 35 Hz frekans aralığında kırmızı kan hücrelerinin reolojik özelliklerini elde etmek için optik cımbız ve bulanıklaştırma mikroskobu kullanan entegre bir protokol kullanılır. Eritrosit-kompleks elastik sabitini ölçmek için optik cımbız kullanılırken, defokus mikroskobu hücre yüksekliği profilini, hacmini ve form faktörünü karmaşık elastik sabitin karmaşık kesme modülüne dönüştürülmesine izin veren bir parametre elde edebilir. Ayrıca, yumuşak camsı bir reoloji modeli uygulanarak, her iki modül için ölçekleme üssü elde edilebilir. Geliştirilen metodoloji, çeşitli fizyolojik ve patolojik durumlar için iyi tanımlanmış deneysel koşullar altında elde edilen viskoelastik parametrelerini karakterize eden kırmızı kan hücrelerinin mekanik davranışlarını keşfetmeye izin verir.
Introduction
Eritrositler olarak da bilinen olgun kırmızı kan hücreleri (RBC’ler), insan vücudunun en dar kılcal damarlarından geçerken boyutlarının iki katından fazla uzayabilirler1. Bu kapasite, dış yüklere maruz kaldıklarında deforme olma konusundaki benzersiz yeteneklerine atfedilir.
Son yıllarda, RBC yüzeylerinde farklı çalışmalar bu özelliği karakterize etmiştir 2,3. Malzemelerin dış yüklerden kaynaklanan elastik ve viskoz tepkilerini tanımlayan fizik alanına reoloji denir. Genel olarak, bir dış kuvvet uygulandığında, ortaya çıkan deformasyon malzemenin özelliklerine bağlıdır ve enerjiyi dağıtan enerjiyi depolayan elastik deformasyonlara veya viskoz deformasyonlara ayrılabilir4. RBC’ler de dahil olmak üzere tüm hücreler viskoelastik bir davranış sergiler; Başka bir deyişle, enerji hem depolanır hem de dağıtılır. Bir hücrenin viskoelastik tepkisi, karmaşık kesme modülü G * (ω) = G’ (ω) + iG “(ω) ile karakterize edilebilir, burada G‘ (ω) elastik davranışla ilgili depolama modülüdür ve G” (ω), viskozitesi4 ile ilgili kayıp modülüdür. Dahası, hücre tepkilerini tanımlamak için fenomenolojik modeller kullanılmıştır, en çok kullanılanlardan biri, karmaşık kesme modülünün yük frekansı ile güç yasası bağımlılığı ile karakterize edilen yumuşak camsı reoloji modeli5 olarak adlandırılır.
RBC’lerin viskoelastik özelliklerini karakterize etmek için, kuvvet uygulayarak ve dayatılan yükün bir fonksiyonu olarak yer değiştirmeyi ölçerek tek hücreli tabanlı yöntemler kullanılmıştır 2,3. Bununla birlikte, kompleks kesme modülü için literatürde çok az sonuç bulunabilir. Dinamik ışık saçılması kullanılarak, RBC depolama ve kayıp modülü için değerlerin 1-100 Hz6 frekans aralığında 0,01-1 Pa arasında değiştiği bildirilmiştir. Optik manyetik büküm sitometrisi kullanılarak, görünür bir kompleks elastik modülelde edildi 7 ve karşılaştırma amacıyla, çarpım faktörünün muhtemelen tutarsızlıkları açıklığa kavuşturduğu iddia edildi.
Daha yakın zamanlarda, zamana bağlı yükler üzerinde insan eritrositlerinin kesme modüllerinin depolanmasını ve kaybını nicel olarak haritalamak için entegre bir araç olarak optik cımbıza (OT) ve defokus mikroskobuna (DM) dayanan yeni bir metodoloji kuruldu 8,9. Ek olarak, sonuçlara uymak ve RBC’leri karakterize eden bir güç yasası katsayısı elde etmek için yumuşak bir camsı reoloji modeli kullanıldı 8,9.
Genel olarak, protokolü aşağıda ayrıntılı olarak açıklanan geliştirilen metodoloji8,9, kuvvet ve deformasyonları RBC yüzeyindeki gerilmeler ve gerinimlerle ilişkilendiren ve farklı kana sahip bireylerden elde edilen RBC’lerin viskoelastik parametrelerini ve yumuşak camsı özelliklerini nicel olarak belirleyebilen yeni bir tanı yöntemi olarak kullanılabilen form faktörü Ff için ölçülen değerleri kullanarak önceki tutarsızlıkları açıklığa kavuşturur Patoloji. Aşağıda açıklanan protokolü kullanarak bu tür bir karakterizasyon, RBC’lerin davranışını mekanobiyolojik bir perspektiften anlamak için yeni olanaklar açabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolde, RBC’lerin viskoelastik özelliklerini nicel olarak haritalamak için optik cımbız ve defokus mikroskobuna dayanan entegre bir yöntem sunulmaktadır. depolama ve kayıp kesme modülü için sonuçlar, RBC’nin yumuşak camsı reolojisini karakterize eden ölçekleme üssü ile birlikte belirlenir. Bu protokolün, fizyolojik durum8’de veya P. falciparum intra-eritrositik siklus9’un her aşaması boyunca olduğu gibi farklı deneysel koşullar için u…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, CENABIO gelişmiş mikroskopi tesisinin tüm üyelerine tüm önemli yardımları için teşekkür etmek isterler. Bu çalışma Brezilya ajansları Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – Financial Code 001, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) ve Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fluidos Complexos (INCT-FCx) ile Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) tarafından desteklenmiştir. B.P., FAPERJ’den bir JCNE hibesi ile desteklendi.
Materials
| 35mm culture dishes | Corning | 430165 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Coverslips | Knittel Glass | VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek Life Sciences | P35G-0-10-C | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Immersion oil | Nikon | MXA22165 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE300 | |
| KaleidaGraph | Synergy Software | https://www.synergy.com/ | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Microscope camera | Hamamatsu | C11440-10C | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neubauer chamber | Sigma-Aldrich | BR717805-1EA | |
| Objective lens | Nikon | PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2 | |
| Optical table | Thorlabs | T1020CK | |
| OT laser | IPG Photonics | YLR-5-1064-LP | |
| Polystyrene microspheres | Polysciences | 17134-15 | |
| rubber ring | Forever Seals | NBR O-Ring | |
| Silicone grease | Dow Corning | Z273554 | |
| Stage positioning | PI | P-545.3R8S | |
| Pipette | Gilson | P1000 |
References
- Fowler, V. M. The human erythrocyte plasma membrane: a Rosetta Stone for decoding membrane-cytoskeleton structure. Current Topics in Membranes. 72, 39-88 (2013).
- Tomaiuolo, G. Biomechanical properties of red blood cells in health and disease towards microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (5), 051501 (2014).
- Depond, M., Henry, B., Buffet, P., Ndour, P. A. Methods to investigate the deformability of RBC during malaria. Frontiers in Physiology. 10, 1613 (2019).
- Boal, D. . Mechanics of the Cell. 2 edn. , (2012).
- Balland, M., et al. Power laws in microrheology experiments on living cells: Comparative analysis and modeling. Physical Review E. 74 (2), 021911 (2006).
- Amin, M. S., et al. Microrheology of red blood cell membranes using dynamic scattering microscopy. Optics Express. 15 (25), 17001-17009 (2007).
- Puig-de-Morales-Marinkovic, M., Turner, K. T., Butler, J. P., Fredberg, J. J., Suresh, S. Viscoelasticity of the human red blood cell. American Journal of Physiology Cell Physiology. 293 (2), 597-605 (2007).
- Gomez, F., et al. Effect of cell geometry in the evaluation of erythrocyte viscoelastic properties. Physical Review E. 101 (6-1), 062403 (2020).
- Gomez, F., et al. Plasmodium falciparum maturation across the intra-erythrocytic cycle shifts the soft glassy viscoelastic properties of red blood cells from a liquid-like towards a solid-like behavior. Experimental Cell Research. 397 (2), 112370 (2020).
- Pompeu, P., et al. Protocol to measure the membrane tension and bending modulus of cells using optical tweezers and scanning electron microscopy. STAR Protocols. 2 (1), 100283 (2021).
- Agero, U., Mesquita, L. G., Neves, B. R., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Defocusing microscopy. Microscopy Research and Technique. 65 (3), 159-165 (2004).
- Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy. Physical Review E. 67 (5), 051904 (2003).
- Roma, P. M. S., Siman, L., Amaral, F. T., Agero, U., Mesquita, O. N. Total three-dimensional imaging of phase objects using defocusing microscopy: Application to red blood cells. Applied Physics Letters. 104 (25), 251107 (2014).
- Köhler, A. New method of illumination for photomicrographical purposes. Journal of the Royal Microscopical Society. 14, 261-262 (1894).
- Nans, A., Mohandas, N., Stokes, D. L. Native ultrastructure of the red cell cytoskeleton by cryo-electron tomography. Biophysical Journal. 101 (10), 2341-2350 (2011).
- Ayala, Y. A., et al. Rheological properties of cells measured by optical tweezers. BMC Biophysics. 9, 5 (2016).
- Ayala, Y. A., et al. Effects of cytoskeletal drugs on actin cortex elasticity. Experimental Cell Research. 351 (2), 173-181 (2017).
