Kvantitativ analyse af viskoelastiske egenskaber af røde blodlegemer ved hjælp af optisk pincet og defokuseringsmikroskopi

Summary

Her beskrives en integreret protokol baseret på optisk pincet og defokuseringsmikroskopi for at måle cellernes rheologiske egenskaber. Denne protokol har bred anvendelighed til at studere erytrocyternes viskoelastiske egenskaber under variable fysiopatologiske tilstande.

Abstract

De viskoelastiske egenskaber af erytrocytter er blevet undersøgt ved en række teknikker. De rapporterede eksperimentelle data varierer imidlertid. Dette tilskrives ikke kun cellernes normale variabilitet, men også forskellene i metoder og modeller af cellerespons. Her anvendes en integreret protokol ved hjælp af optisk pincet og defokuseringsmikroskopi til at opnå de rheologiske egenskaber ved røde blodlegemer i frekvensområdet 1 Hz til 35 Hz. Mens optisk pincet bruges til at måle den erytrocyt-komplekse elastiske konstant, er defokuseringsmikroskopi i stand til at opnå cellehøjdeprofilen, volumenet og dens formfaktor en parameter, der tillader omdannelse af kompleks elastisk konstant til komplekst forskydningsmodul. Desuden kan man ved anvendelse af en blød glasagtig reologimodel opnå skaleringseksponenten for begge moduli. Den udviklede metode gør det muligt at udforske den mekaniske opførsel af røde blodlegemer, der karakteriserer deres viskoelastiske parametre, opnået under veldefinerede eksperimentelle betingelser for flere fysiologiske og patologiske tilstande.

Introduction

Modne røde blodlegemer (RBC’er), også kendt som erythrocytter, er i stand til at strække sig mere end dobbelt så meget, når de passerer gennem de smaleste kapillærer i menneskekroppen¹. En sådan kapacitet tilskrives deres unikke evne til at deformere, når de udsættes for eksterne belastninger.

I de senere år har forskellige undersøgelser karakteriseret denne funktion i RBC-overflader ^2,3. Det område af fysikken, der beskriver de elastiske og viskøse reaktioner af materialer på grund af ydre belastninger, kaldes reologi. Generelt, når en ekstern kraft påføres, afhænger den resulterende deformation af materialets egenskaber og kan opdeles i elastiske deformationer, der lagrer energi eller viskøse deformationer, der spreder energi⁴. Alle celler, herunder RBC’er, udviser en viskoelastisk adfærd; Med andre ord er energi både lagret og spredt. Den viskoelastiske respons af en celle kan således karakteriseres ved dens komplekse forskydningsmodul G * (ω) = G‘(ω) + iG“(ω), hvor G ‘(ω) er lagringsmodulet, relateret til den elastiske opførsel, og G” (ω) er tabsmodulet, relateret til dets viskositet⁴. Desuden er fænomenologiske modeller blevet brugt til at beskrive celleresponser, en af de mest anvendte kaldes den bløde glasagtige reologimodel⁵, kendetegnet ved en magtlovafhængighed af det komplekse forskydningsmodul med belastningsfrekvensen.

Enkeltcellebaserede metoder er blevet anvendt til at karakterisere RBC’ernes viskoelastiske egenskaber ved at anvende kraft og måle forskydning som en funktion af den pålagte belastning ^2,3. For det komplekse forskydningsmodul kan der imidlertid kun findes få resultater i litteraturen. Ved hjælp af dynamisk lysspredning blev værdier for RBC-lagring og tabsmoduli rapporteret varierende fra 0,01-1 Pa i frekvensområdet 1-100 Hz⁶. Ved anvendelse af optisk magnetisk vridningscytometri blev der opnået et tilsyneladende komplekst elastisk modul⁷, og til sammenligningsformål blev en multiplikativ faktor hævdet for muligvis at afklare uoverensstemmelserne.

For nylig blev der etableret en ny metode baseret på optisk pincet (OT) sammen med defokuseringsmikroskopi (DM) som et integreret værktøj til kvantitativt at kortlægge lagring og tab af forskydningsmoduler af humane erytrocytter over tidsafhængige belastninger ^8,9. Derudover blev en blød glasagtig reologimodel brugt til at passe resultaterne og opnå en effektlovkoefficient, der karakteriserer RBC’erne ^8,9.

Samlet set præciserer den udviklede metode^8,9, hvis protokol er beskrevet detaljeret nedenfor, tidligere uoverensstemmelser ved at anvende de målte værdier for formfaktoren, F_f, der relaterer kræfter og deformationer til spændinger og belastninger i RBC-overfladen og kan anvendes som en ny diagnostisk metode^, der er i stand til kvantitativt at bestemme de viskoelastiske parametre og bløde glasagtige egenskaber ved RBC’er opnået fra personer med forskelligt blod Patologier. En sådan karakterisering ved hjælp af protokollen beskrevet nedenfor kan åbne nye muligheder for at forstå RBC’ernes adfærd fra et mekanobiologisk perspektiv.

Protocol

Humane blodprøver blev leveret af voksne mænd og kvinder frivillige i henhold til protokoller godkendt af Research Ethics Committee ved Federal University of Rio de Janeiro (protokol 2.889.952) og registreret i Brasilien Platform under CAAE nummer 88140418.5.0000.5699. En skriftlig form for samtykke blev udstedt til og indsamlet fra alle frivillige. Dem med hæmoglobinopati og / eller tager kontrolleret medicin blev udelukket. Hele processen fulgte de retningslinjer, der blev godkendt af instituttets etiske udvalg….

Representative Results

Figur 1 viser skemaerne for OT-systemet, der anvendes til reologimålingerne. Figur 2 viser skemaerne for mikrorheologieksperimentet med begge sfærer, og en repræsentativ RBC vises også. Figur 3 viser en typisk kurve for amplituderne af begge sfærer som funktion af tiden, når sinusformede bevægelser produceres af det piezoelektriske stadium. Mens referencekuglen (figur 3 – rød kurve) svinger efter scenebevægelsen, svinger RB…

Discussion

I denne protokol præsenteres en integreret metode baseret på optisk pincet og defokuseringsmikroskopi for kvantitativt at kortlægge de viskoelastiske egenskaber af RBC’er. Resultaterne for lagrings- og tabsforskydningsmoduliet sammen med skaleringseksponenten, der karakteriserer RBC’s bløde glasagtige reologi, bestemmes. Anvendelse af denne protokol til forskellige eksperimentelle betingelser, såsom i fysiologisk situation⁸ eller langs hvert trin i P. falciparum intra-erythrocytisk c…

Materials

35mm culture dishes	Corning	430165
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A9418
Coverslips	Knittel Glass	VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01
Glass-bottom dishes	MatTek Life Sciences	P35G-0-10-C
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/
Immersion oil	Nikon	MXA22165
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TE300
KaleidaGraph	Synergy Software	https://www.synergy.com/
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
Microscope camera	Hamamatsu	C11440-10C
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
Neubauer chamber	Sigma-Aldrich	BR717805-1EA
Objective lens	Nikon	PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2
Optical table	Thorlabs	T1020CK
OT laser	IPG Photonics	YLR-5-1064-LP
Polystyrene microspheres	Polysciences	17134-15
rubber ring	Forever Seals	NBR O-Ring
Silicone grease	Dow Corning	Z273554
Stage positioning	PI	P-545.3R8S
Pipette	Gilson	P1000