Kvantitativ analys av viskoelastiska egenskaper hos röda blodkroppar med hjälp av optisk pincett och defokuseringsmikroskopi
Summary
Här beskrivs ett integrerat protokoll baserat på optisk pincett och defokuseringsmikroskopi för att mäta cellernas reologiska egenskaper. Detta protokoll har bred tillämplighet vid studier av erytrocyters viskoelastiska egenskaper under variabla fysiopatologiska förhållanden.
Abstract
De viskoelastiska egenskaperna hos erytrocyter har undersökts med en rad tekniker. De rapporterade experimentella data varierar dock. Detta tillskrivs inte bara cellernas normala variabilitet utan också skillnaderna i metoder och modeller för cellrespons. Här används ett integrerat protokoll som använder optisk pincett och defokuseringsmikroskopi för att erhålla de reologiska egenskaperna hos röda blodkroppar i frekvensområdet 1 Hz till 35 Hz. Medan optiska pincetter används för att mäta den erytrocytkomplexa elastiska konstanten, kan defokuseringsmikroskopi erhålla cellhöjdsprofilen, volymen och dess formfaktor en parameter som möjliggör omvandling av komplex elastisk konstant till komplex skjuvmodul. Genom att tillämpa en mjuk glasartad reologimodell kan skalningsexponenten för båda modulerna erhållas. Den utvecklade metoden gör det möjligt att utforska det mekaniska beteendet hos röda blodkroppar, som karakteriserar deras viskoelastiska parametrar, erhållna under väldefinierade experimentella betingelser, för flera fysiologiska och patologiska tillstånd.
Introduction
Mogna röda blodkroppar (RBC), även kända som erytrocyter, kan sträcka sig mer än dubbelt så stor när de passerar genom de smalaste kapillärerna i människokroppen1. Sådan kapacitet tillskrivs deras unika förmåga att deformeras när de utsätts för yttre belastningar.
Under de senaste åren har olika studier karakteriserat denna funktion i RBC-ytor 2,3. Fysikområdet som beskriver de elastiska och viskösa svaren hos material på grund av yttre belastningar kallas reologi. I allmänhet, när en yttre kraft appliceras, beror den resulterande deformationen på materialets egenskaper och kan delas in i elastiska deformationer, som lagrar energi eller viskösa deformationer, som sprider energi4. Alla celler, inklusive röda blodkroppar, uppvisar ett viskoelastiskt beteende; Med andra ord både lagras och försvinner energi. Det viskoelastiska svaret hos en cell kan således karakteriseras av dess komplexa skjuvmodul G * (ω) = G‘(ω) + iG “(ω), där G ‘(ω) är lagringsmodulen, relaterad till det elastiska beteendet, och G” (ω) är förlustmodulen, relaterad till dess viskositet4. Dessutom har fenomenologiska modeller använts för att beskriva cellsvar, en av de mest använda kallas den mjuka glasartade reologimodellen5, kännetecknad av ett kraftlagsberoende av den komplexa skjuvmodulen med belastningsfrekvensen.
Encellsbaserade metoder har använts för att karakterisera de viskoelastiska egenskaperna hos RBC, genom att applicera kraft och mäta förskjutning som en funktion av den pålagda belastningen 2,3. För den komplexa skjuvmodulen finns dock få resultat i litteraturen. Med hjälp av dynamisk ljusspridning rapporterades värden för RBC-lagring och förlustmoduler som varierade från 0,01-1 Pa, i frekvensområdet 1-100 Hz6. Genom att använda optisk magnetisk vridcytometri erhölls en uppenbar komplex elastisk modul7, och för jämförelseändamål hävdades en multiplikativ faktor för att möjligen klargöra skillnaderna.
Mer nyligen etablerades en ny metod baserad på optisk pincett (OT) tillsammans med defokuseringsmikroskopi (DM), som ett integrerat verktyg för att kvantitativt kartlägga lagring och förlust av skjuvmodul hos humana erytrocyter över tidsberoende belastningar, 8,9. Dessutom användes en mjuk glasartad reologimodell för att passa resultaten och erhålla en effektlagskoefficient som kännetecknar RBC: erna 8,9.
Sammantaget klargör den utvecklade metoden8,9, vars protokoll beskrivs i detalj nedan, tidigare avvikelser genom att använda de uppmätta värdena för formfaktorn, Ff, som relaterar krafter och deformationer till spänningar och töjningar i RBC-ytan och kan användas som en ny diagnostisk metod som kvantitativt kan bestämma de viskoelastiska parametrarna och mjuka glasartade egenskaperna hos RBC erhållna från individer med olika blod Patologier. Sådan karakterisering, med hjälp av protokollet som beskrivs nedan, kan öppna nya möjligheter att förstå beteendet hos RBC ur ett mekanobiologiskt perspektiv.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta protokoll presenteras en integrerad metod baserad på optisk pincett och defokuseringsmikroskopi för att kvantitativt kartlägga de viskoelastiska egenskaperna hos RBC. Resultat för lagrings- och förlustskjuvmodulen, tillsammans med skalningsexponenten som kännetecknar den mjuka glasartade reologin hos RBC bestäms. Tillämpning av detta protokoll för olika experimentella betingelser, såsom i fysiologisk situation8 eller längs varje stadium av P. falciparum intraerytrocytis…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka alla medlemmar i CENABIO avancerade mikroskopianläggning för all viktig hjälp. Detta arbete stöddes av de brasilianska byråerna Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – Financial Code 001, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) och Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fluidos Complexos (INCT-FCx) tillsammans med Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). B.P. stöddes av ett JCNE-bidrag från FAPERJ.
Materials
| 35mm culture dishes | Corning | 430165 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Coverslips | Knittel Glass | VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek Life Sciences | P35G-0-10-C | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Immersion oil | Nikon | MXA22165 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE300 | |
| KaleidaGraph | Synergy Software | https://www.synergy.com/ | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Microscope camera | Hamamatsu | C11440-10C | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neubauer chamber | Sigma-Aldrich | BR717805-1EA | |
| Objective lens | Nikon | PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2 | |
| Optical table | Thorlabs | T1020CK | |
| OT laser | IPG Photonics | YLR-5-1064-LP | |
| Polystyrene microspheres | Polysciences | 17134-15 | |
| rubber ring | Forever Seals | NBR O-Ring | |
| Silicone grease | Dow Corning | Z273554 | |
| Stage positioning | PI | P-545.3R8S | |
| Pipette | Gilson | P1000 |
References
- Fowler, V. M. The human erythrocyte plasma membrane: a Rosetta Stone for decoding membrane-cytoskeleton structure. Current Topics in Membranes. 72, 39-88 (2013).
- Tomaiuolo, G. Biomechanical properties of red blood cells in health and disease towards microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (5), 051501 (2014).
- Depond, M., Henry, B., Buffet, P., Ndour, P. A. Methods to investigate the deformability of RBC during malaria. Frontiers in Physiology. 10, 1613 (2019).
- Boal, D. . Mechanics of the Cell. 2 edn. , (2012).
- Balland, M., et al. Power laws in microrheology experiments on living cells: Comparative analysis and modeling. Physical Review E. 74 (2), 021911 (2006).
- Amin, M. S., et al. Microrheology of red blood cell membranes using dynamic scattering microscopy. Optics Express. 15 (25), 17001-17009 (2007).
- Puig-de-Morales-Marinkovic, M., Turner, K. T., Butler, J. P., Fredberg, J. J., Suresh, S. Viscoelasticity of the human red blood cell. American Journal of Physiology Cell Physiology. 293 (2), 597-605 (2007).
- Gomez, F., et al. Effect of cell geometry in the evaluation of erythrocyte viscoelastic properties. Physical Review E. 101 (6-1), 062403 (2020).
- Gomez, F., et al. Plasmodium falciparum maturation across the intra-erythrocytic cycle shifts the soft glassy viscoelastic properties of red blood cells from a liquid-like towards a solid-like behavior. Experimental Cell Research. 397 (2), 112370 (2020).
- Pompeu, P., et al. Protocol to measure the membrane tension and bending modulus of cells using optical tweezers and scanning electron microscopy. STAR Protocols. 2 (1), 100283 (2021).
- Agero, U., Mesquita, L. G., Neves, B. R., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Defocusing microscopy. Microscopy Research and Technique. 65 (3), 159-165 (2004).
- Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy. Physical Review E. 67 (5), 051904 (2003).
- Roma, P. M. S., Siman, L., Amaral, F. T., Agero, U., Mesquita, O. N. Total three-dimensional imaging of phase objects using defocusing microscopy: Application to red blood cells. Applied Physics Letters. 104 (25), 251107 (2014).
- Köhler, A. New method of illumination for photomicrographical purposes. Journal of the Royal Microscopical Society. 14, 261-262 (1894).
- Nans, A., Mohandas, N., Stokes, D. L. Native ultrastructure of the red cell cytoskeleton by cryo-electron tomography. Biophysical Journal. 101 (10), 2341-2350 (2011).
- Ayala, Y. A., et al. Rheological properties of cells measured by optical tweezers. BMC Biophysics. 9, 5 (2016).
- Ayala, Y. A., et al. Effects of cytoskeletal drugs on actin cortex elasticity. Experimental Cell Research. 351 (2), 173-181 (2017).
