ביסוס אורגנואידים של ריאות אנושיות והתמיינות פרוקסימלית ליצירת אורגנואידים בוגרים של דרכי הנשימה
Summary
הפרוטוקול מציג שיטה להפקת אורגנואידים של ריאה אנושית מרקמות ריאה ראשוניות, הרחבת האורגנואידים של הריאה וגרימת התמיינות פרוקסימלית ליצירת אורגנואידים תלת-ממדיים ודו-ממדיים של דרכי הנשימה, המנצלים בנאמנות את אפיתל דרכי הנשימה האנושיות.
Abstract
היעדר מודל חוץ גופי חזק של אפיתל הנשימה האנושי מעכב את הבנת הביולוגיה והפתולוגיה של מערכת הנשימה. אנו מתארים פרוטוקול מוגדר להפקת אורגנואידים של ריאה אנושית מתאי גזע בוגרים ברקמת הריאה ולגרום להתמיינות פרוקסימלית ליצירת אורגנואידים בוגרים של דרכי הנשימה. האורגנואידים של הריאה מורחבים ברציפות במשך למעלה משנה עם יציבות גבוהה, בעוד שהאורגנואידים המובחנים של דרכי הנשימה משמשים כדי לדמות באופן מורפולוגי ותפקודי אפיתל דרכי הנשימה האנושי לרמה כמעט פיזיולוגית. לפיכך, אנו יוצרים מודל אורגנואידי חזק של אפיתל דרכי הנשימה האנושיות. ההתרחבות ארוכת הטווח של אורגנואידים של ריאה ואורגנואידים מובחנות של דרכי הנשימה מייצרת מקור יציב ומתחדש, ומאפשרת למדענים לשחזר ולהרחיב את תאי האפיתל של דרכי הנשימה האנושיות במנות תרבית. מערכת האורגנואידים של הריאה האנושית מספקת מודל ייחודי ופעיל מבחינה פיזיולוגית במבחנה עבור יישומים שונים, כולל חקר אינטראקציה בין נגיף למארח, בדיקות תרופות ומידול מחלות.
Introduction
אורגנואידים הפכו לכלי חזק ואוניברסלי למידול חוץ גופי של התפתחות איברים ולחקר ביולוגיה ומחלות. כאשר מתרבים בתרבית במדיום תרבית המוגדר על ידי גורם גדילה, תאי גזע בוגרים (ASC) ממגוון איברים ניתנים להרחבה בתלת-ממד (3D) ולהרכיב את עצמם לאשכולות תאיים דמויי איברים המורכבים מסוגי תאים מרובים, המכונים אורגנואידים. המעבדה של Clevers דיווחה על הנגזרת של האורגנואיד הראשון שמקורו ב-ASC, אורגנואיד מעיים אנושי, בשנת 2009 1,2. לאחר מכן, אורגנואידים שמקורם ב-ASC הוקמו עבור מגוון של איברים ורקמות אנושיות, כולל ערמונית 3,4, כבד 5,6, קיבה 7,8,9, לבלב10, בלוטת החלב11 וריאה 12,13 . אורגנואידים אלה שמקורם ב-ASC שמרו על התכונות התאית, המבנית והתפקודית הקריטיות של האיבר המקומי ושמרו על יציבות גנטית ופנוטיפית בתרבית ההתפשטות ארוכת הטווח14,15.
אורגנואידים יכולים גם להיגזר מתאי גזע פלוריפוטנטיים (PSC), כולל תאי גזע עובריים (ES) ותאי גזע פלוריפוטנטי מושרים (iPS)16. בעוד שאורגנואידים שמקורם ב-PSC מנצלים את מנגנוני התפתחות האיברים לצורך הקמתם, ניתן לכפות ASCs ליצור אורגנואידים על ידי בנייה מחדש של תנאים המחקים את נישת תאי הגזע במהלך חידוש עצמי של רקמות פיזיולוגיות או תיקון רקמות. אורגנואידים שמקורם ב-PSC הם מודלים נוחים לחקר ההתפתחות והאורגנוגנזה, אם כי אינם מסוגלים להגיע לרמת ההבשלה הדומה של אורגנואידים שמקורם ב-ASC. מצב ההבשלה דמוי העובר של אורגנואידים שמקורם ב-PSC, והמורכבות לביסוס אורגנואידים אלה מונעים באופן משמעותי את היישומים הרחבים שלהם לחקר ביולוגיה ופתולוגיה ברקמות בוגרות.
מערכת הנשימה האנושית, מהאף ועד הסימפונות הטרמינליים, מרופדת באפיתל דרכי הנשימה, המכונה גם אפיתל הציליאתי המדומה, המורכב מארבעה סוגי תאים עיקריים, כלומר תאים סיליים, תא גביע, תא בסיס ותא מועדון. הקמנו את אורגנואיד הריאה האנושית שמקורו ב-ASC מרקמות ריאה אנושיות בשיתוף עם המעבדה של Clevers12,13. אורגנואידים ריאה אלה מורחבים ברציפות במדיום ההתפשטות במשך למעלה משנה; משך הזמן המדויק משתנה בין קווים אורגנואידים שונים המתקבלים מתורמים שונים. עם זאת, בהשוואה לאפיתל הטבעי של דרכי הנשימה, אורגנואידי ריאה אלה הניתנים להרחבה ארוכת טווח אינם בוגרים מספיק מכיוון שתאים ציליאנטים, אוכלוסיית התאים העיקרית בדרכי הנשימה האנושיות, סובלים מתת-ייצוג באורגנואידים של ריאה אלה. לפיכך, פיתחנו פרוטוקול התמיינות פרוקסימלית ויצרנו אורגנואידים תלת-ממדיים ודו-ממדיים של דרכי הנשימה, אשר מבחינה מורפולוגית ותפקודית פנוסקופיה של אפיתל דרכי הנשימה לרמה כמעט פיזיולוגית.
כאן אנו מספקים פרוטוקול וידאו להפקת אורגנואידים של ריאה אנושית מרקמות הריאה הראשוניות, הרחבת האורגנואידים של הריאה וגרימת התמיינות פרוקסימלית ליצירת אורגנואידים תלת-ממדיים ודו-ממדיים של דרכי הנשימה.
Protocol
Representative Results
Discussion
דרכי הנשימה האנושיות מרופדות באפיתל דרכי הנשימה, הידוע גם בשם אפיתל הציליאתי המדומה. סוגי התאים העיקריים של אפיתל דרכי הנשימה העליונות הם תאים מצומדים המאפשרים לתנועה מתואמת של הריסונים האפיקליים שלהם לגרש ריר וחלקיקים בשאיפה מדרכי הנשימה, תאי גביע המייצרים ומפרישים ריר, ותאי בסיס התוחמ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למרכז למדעי PanorOmic וליחידת מיקרוסקופ אלקטרונים, הפקולטה לרפואה ע”ש לי קה שינג, אוניברסיטת הונג קונג, על הסיוע בהדמיה קונפוקלית ובציטומטריית זרימה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מימון מקרן המחקר לבריאות ורפואה (HMRF, 17161272 ו-19180392) של לשכת המזון והבריאות; קרן המחקר הכללית (GRF, 17105420) של המועצה למענקי מחקר; Health@InnoHK, ועדת החדשנות והטכנולוגיה, ממשלת האזור המנהלי המיוחד של הונג קונג.
Materials
| Reagents for lung organoid culture | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | – |
| A8301 | Tocris | 2939 | 500nM |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 1x |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2) | Trevigen | 3533-010-0 | 70-80% |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
| GlutaMAX (glutamine) | Invitrogen | 35050061 | 1x |
| HEPES 1M | Invitrogen | 15630-056 | 10 mM |
| Heregulin β-1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Noggin (conditional medium) | home made | – | 10x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen | 15140-122 | 1x |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
| Rspondin1 (conditional medium) | home made | – | 10x |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | 1 µM |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 µM |
| Proximal differentiation medium | |||
| DAPT | Tocris | 2634 | 10 µM |
| Heparin Solution | StemCell Technology | 7980 | 4 µg/mL |
| Hydrocortisone Stock Solution | StemCell Technology | 7925 | 1 µM |
| PneumaCult-ALI 10X Supplement | air liquid interface supplement | ||
| PneumaCult-ALI Basal Medium | StemCell Technology | 05001 | air liquid interface basal medium |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement | air liquid interface maintenance supplement | ||
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 10 µM |
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | Baker | 1-800-992-2537 | |
| Carl Zeiss LSM 780 or 800 | Zeiss | confocal microscope | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 42093483 | |
| Stereo-microscope | Olympus Corporation | CKX31SF | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418BG040397 | |
| Serological pipettor | Eppendorf | ||
| Micropipette | Eppendorf | ||
| ZEN black or ZEN blue software | Zeiss | analysis software | |
| Consumables | |||
| 12mm Trans-well | StemCell Technology | #38023 | |
| 12-well cell culture plate | Cellstar | 665970 | |
| 15- and 50 ml conical tubes | Thermo Fisher Scientific | L6BF5Z8118 | |
| 24-well cell culture plate | Cellstar | 662160 | |
| 6.5mm Trans-well | StemCell Technology | #38024 | |
| Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Sigma-Aldrich | SLGPR33RB | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | ||
| Micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | TFLR140-200-Q21190531 | |
| Pasteur pipette glass | Thermo Fisher Scientific | 22-378893 | |
| Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml) | Thermo Fisher Scientific | BA08003, 08004, 08005 | |
| Antibodies | |||
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11007 | |
| Mouse Anti-Cytokeratin 5 | Abcam | ab128190 | |
| Mouse Anti-FOX J1 | Invitrogen | 14-9965-82 | |
| Mouse Anti-Mucin 5AC | Abcam | ab3649 | |
| Mouse Anti-β-tubulin 4 | Sigma | T7941 | |
| Rabbit Anti-p63 | Abcam | ab124762 | |
| Rat Anti-Uteroglobin/CC-10 | R&D Systems | MAB4218-SP | |
| Other reagent | |||
| TrypLE Select Enzyme (10X) | Thermo Fisher Scientific | A1217701 | dissociation enzyme |
References
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).
- Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Wroblewski, L. E., et al. Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells. Gut. 64 (5), 720-730 (2015).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Zhou, J., et al. Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Lancaster, M. A., Huch, M. Disease modelling in human organoids. Disease Model Mechanisms. 12 (7), (2019).
- . Millicell ERS-2 User Guide Available from: https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5 (2021)
- Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. eLife. 4, 05098 (2015).
- Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells. Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).
- Glinka, A., et al. LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling. EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).
- Groppe, J., et al. Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin. Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).
- Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors. Development. 143 (5), 764-773 (2016).
- Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
- Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation. Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).
- Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids in immunological research. Nature Reviews. Immunology. 20 (5), 279-293 (2019).
- Drost, J., Clevers, H. Translational applications of adult stem cell-derived organoids. Development. 144 (6), 968-975 (2017).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Zhou, J., et al. Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2. Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).
- Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
- Han, Y., et al. Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids. Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).
- Mykytyn, A. Z., et al. SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site. eLife. 10, 64508 (2021).
- Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
- Lamers, M. M., et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369 (6499), 50-54 (2020).
- Mallapaty, S. The mini lungs and other organoids helping to beat COVID. Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).
