성숙한 기도 오가노이드를 생성하기 위해 인간 폐 오가노이드 및 근위 분화 확립
Summary
이 프로토콜은 원발성 폐 조직으로부터 인간 폐 오가노이드를 유도하고, 폐 오가노이드를 확장시키고, 근위 분화를 유도하여 인간 기도 상피를 충실하게 표현 복사하는 3D 및 2D 기도 오가노이드를 생성하는 방법을 제시한다.
Abstract
인간 호흡 상피의 강력한 시험관 내 모델의 부족은 호흡기의 생물학 및 병리학에 대한 이해를 방해합니다. 우리는 폐 조직의 성체 줄기 세포로부터 인간 폐 오가노이드를 유도하고 성숙한 기도 오가노이드를 생성하기 위해 근위 분화를 유도하는 정의된 프로토콜을 기술한다. 폐 오가노이드는 높은 안정성으로 1 년 이상 연속적으로 확장되는 반면, 분화 된기도 오가노이드는 형태 학적으로나 기능적으로 인간의 기도 상피를 거의 생리적 수준으로 시뮬레이션하는 데 사용됩니다. 따라서, 우리는 인간기도 상피의 강력한 오가노이드 모델을 확립합니다. 폐 오가노이드와 분화 된기도 오가노이드의 장기간 확장은 안정적이고 재생 가능한 공급원을 생성하여 과학자들이 배양 접시에서 인간기도 상피 세포를 재구성하고 확장 할 수있게합니다. 인간 폐 오가노이드 시스템은 바이러스-숙주 상호작용 연구, 약물 테스트 및 질병 모델링을 포함한 다양한 응용을 위한 독특하고 생리활성 시험관내 모델을 제공한다.
Introduction
오가노이드는 장기 발달의 시험관 내 모델링과 생물학 및 질병 연구를위한 강력하고 보편적 인 도구가되었습니다. 성장 인자 정의 배양 배지에서 배양하는 경우, 다양한 장기로부터의 성체 줄기 세포 (ASC)는 3차원 (3D)으로 확장될 수 있고 오가노이드라고 불리는 다중 세포 유형으로 구성된 장기 유사 세포 클러스터로 자기조립될 수 있다. 클레버즈의 실험실은 2009 년 1,2 년에 최초의 ASC 유래 오가노이드 인 인간 장내 오가노이드의 유도를보고했다. 그 후, ASC 유래 오가노이드는 전립선 3,4, 간 5,6, 위 7,8,9, 췌장 10, 유선 11 및 폐 12,13을 포함한 다양한 인간 장기 및 조직에 대해 확립되었다. . 이들 ASC 유래 오가노이드는 천연 장기의 중요한 세포, 구조적, 기능적 특성을 유지하고, 장기 확장 배양물에서 유전적 및 표현형 안정성을 유지하였다(14,15).
오가노이드는 또한 배아 줄기 (ES) 세포 및 유도 만능 줄기 (iPS) 세포 (16)를 포함하는 만능 줄기 세포 (PSC)로부터 유래될 수 있다. PSC 유래 오가노이드는 그들의 설립을 위해 장기 발달의 메커니즘을 이용하는 반면, ASC는 생리적 인 조직 자체 재생 또는 조직 복구 중에 줄기 세포 틈새를 모방하는 조건을 재건함으로써 오가노이드를 형성하도록 강요 될 수 있습니다. PSC 유래 오가노이드는 ASC 유래 오가노이드의 비교 가능한 성숙 수준에 도달 할 수는 없지만 발달 및 유기 발생을 탐구하는 데 유리한 모델입니다. PSC 유래 오가노이드의 태아와 유사한 성숙 상태 및 이러한 오가노이드를 확립하기위한 복잡성은 성숙한 조직에서 생물학 및 병리학을 연구하기위한 광범위한 적용을 실질적으로 방해합니다.
코에서 말단 세기관지까지 인간의 호흡기는 기도 상피(pseudostratified ciliated epithelium)라고도 불리우며, 이는 네 가지 주요 세포 유형, 즉 섬모 세포, 잔 세포, 기저 세포 및 클럽 세포로 구성됩니다. 우리는 Clevers의 실험실12,13과 협력하여 인간 폐 조직에서 ASC 유래 인간 폐 오가노이드를 설립했습니다. 이들 폐 오가노이드는 일 년 이상 동안 확장 배지에서 연속적으로 확장되고; 정확한 지속 기간은 다른 기증자로부터 얻은 다른 오가노이드 라인에 따라 다릅니다. 그러나, 천연 기도 상피와 비교하여, 이러한 장기 팽창성 폐 오가노이드는 인간 기도의 주요 세포 집단인 섬모 세포가 이들 폐 오가노이드에서 과소 대표되기 때문에 충분히 성숙하지 않다. 따라서, 우리는 근위 분화 프로토콜을 개발하고기도 상피를 거의 생리적 수준으로 형태학적으로 그리고 기능적으로 표현 복사하는 3D 및 2D 기도 오가노이드를 생성했습니다.
여기서 우리는 원발성 폐 조직으로부터 인간 폐 오가노이드를 유도하고, 폐 오가노이드를 확장시키고, 3D 및 2D 기도 오가노이드를 생성하기 위해 근위 분화를 유도하는 비디오 프로토콜을 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
인간 기도는 의사 층화 된 섬모 상피라고도 알려진 기도 상피와 줄 지어 있습니다. 상부 기도 상피의 주요 세포 유형은 기도에서 점액과 흡입된 입자를 배출하기 위해 정수리 섬모의 조율된 이동을 가능하게 하는 섬모 세포, 점액을 생산하고 분비하는 잔 세포, 기저막을 늘어서서 재생에 연루된 기저 세포이다. 세기관지와 같은 작은 기도에서, 입방체 기도 상피는 분비 클럽 세포를 포함하고 상부 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 공초점 이미징 및 유세포 측정에 도움을 주신 PanorOmic Sciences and Electron Microscope Unit, Li Ka Shing Faculty of Medicine, Hong Kong에 감사드립니다. 이 작업은 식품 보건국의 건강 및 의료 연구 기금 (HMRF, 17161272 및 19180392)의 기금으로 부분적으로 지원되었습니다. 연구 보조금위원회의 일반 연구 기금 (GRF, 17105420); Health@InnoHK, 혁신 기술위원회, 홍콩 특별 행정 구역 정부.
Materials
| Reagents for lung organoid culture | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | – |
| A8301 | Tocris | 2939 | 500nM |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 1x |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2) | Trevigen | 3533-010-0 | 70-80% |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
| GlutaMAX (glutamine) | Invitrogen | 35050061 | 1x |
| HEPES 1M | Invitrogen | 15630-056 | 10 mM |
| Heregulin β-1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Noggin (conditional medium) | home made | – | 10x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen | 15140-122 | 1x |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
| Rspondin1 (conditional medium) | home made | – | 10x |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | 1 µM |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 µM |
| Proximal differentiation medium | |||
| DAPT | Tocris | 2634 | 10 µM |
| Heparin Solution | StemCell Technology | 7980 | 4 µg/mL |
| Hydrocortisone Stock Solution | StemCell Technology | 7925 | 1 µM |
| PneumaCult-ALI 10X Supplement | air liquid interface supplement | ||
| PneumaCult-ALI Basal Medium | StemCell Technology | 05001 | air liquid interface basal medium |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement | air liquid interface maintenance supplement | ||
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 10 µM |
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | Baker | 1-800-992-2537 | |
| Carl Zeiss LSM 780 or 800 | Zeiss | confocal microscope | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 42093483 | |
| Stereo-microscope | Olympus Corporation | CKX31SF | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418BG040397 | |
| Serological pipettor | Eppendorf | ||
| Micropipette | Eppendorf | ||
| ZEN black or ZEN blue software | Zeiss | analysis software | |
| Consumables | |||
| 12mm Trans-well | StemCell Technology | #38023 | |
| 12-well cell culture plate | Cellstar | 665970 | |
| 15- and 50 ml conical tubes | Thermo Fisher Scientific | L6BF5Z8118 | |
| 24-well cell culture plate | Cellstar | 662160 | |
| 6.5mm Trans-well | StemCell Technology | #38024 | |
| Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Sigma-Aldrich | SLGPR33RB | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | ||
| Micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | TFLR140-200-Q21190531 | |
| Pasteur pipette glass | Thermo Fisher Scientific | 22-378893 | |
| Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml) | Thermo Fisher Scientific | BA08003, 08004, 08005 | |
| Antibodies | |||
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11007 | |
| Mouse Anti-Cytokeratin 5 | Abcam | ab128190 | |
| Mouse Anti-FOX J1 | Invitrogen | 14-9965-82 | |
| Mouse Anti-Mucin 5AC | Abcam | ab3649 | |
| Mouse Anti-β-tubulin 4 | Sigma | T7941 | |
| Rabbit Anti-p63 | Abcam | ab124762 | |
| Rat Anti-Uteroglobin/CC-10 | R&D Systems | MAB4218-SP | |
| Other reagent | |||
| TrypLE Select Enzyme (10X) | Thermo Fisher Scientific | A1217701 | dissociation enzyme |
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