Etablering av humane lungeorganoider og proksimal differensiering for å generere modne luftveisorganoider
Summary
Protokollen presenterer en metode for å utlede humane lungeorganoider fra primære lungevev, utvide lungeorganoidene og indusere proksimal differensiering for å generere 3D- og 2D-luftveisorganoider som trofast fenokopierer det menneskelige luftveisepitelet.
Abstract
Mangelen på en robust in vitro-modell av det menneskelige respiratoriske epitelet hindrer forståelsen av biologien og patologien i luftveiene. Vi beskriver en definert protokoll for å utlede humane lungeorganoider fra voksne stamceller i lungevevet og indusere proksimal differensiering for å generere modne luftveisorganoider. Lungeorganoidene utvides deretter fortløpende i over 1 år med høy stabilitet, mens de differensierte luftveisorganoidene brukes til å morfologisk og funksjonelt simulere humant luftveisepiteli til et nesten fysiologisk nivå. Dermed etablerer vi en robust organoid modell av det menneskelige luftveisepitelet. Den langsiktige utvidelsen av lungeorganoider og differensierte luftveisorganoider genererer en stabil og fornybar kilde, slik at forskere kan rekonstruere og utvide de menneskelige luftveisepitelcellene i kulturretter. Det humane lungeorganoidsystemet gir en unik og fysiologisk aktiv in vitro-modell for ulike bruksområder, inkludert studier av virusvertsinteraksjon, legemiddeltesting og sykdomsmodellering.
Introduction
Organoider har blitt et robust og universelt verktøy for in vitro modellering av organutvikling og studier av biologi og sykdom. Når de dyrkes i et vekstfaktordefinert kulturmedium, kan voksne stamceller (ASC) fra en rekke organer utvides i 3-dimensjon (3D) og selvmontert i organlignende cellulære klynger sammensatt av flere celletyper, kalt organoider. Clevers’ laboratorium rapporterte avledningen av den første ASC-avledede organoiden, humant tarmorganoid, i 2009 1,2. Etterpå er ASC-avledede organoider etablert for en rekke menneskelige organer og vev, inkludert prostata 3,4, lever 5,6, mage 7,8,9, bukspyttkjertel10, brystkjertel11 og lunge 12,13 . Disse ASC-avledede organoidene beholdt de kritiske cellulære, strukturelle og funksjonelle egenskapene til det opprinnelige organet og opprettholdt genetisk og fenotypisk stabilitet i langsiktig ekspansjonskultur14,15.
Organoider kan også avledes fra pluripotente stamceller (PSC), inkludert embryonale stammeceller (ES) og indusert pluripotentstamme (iPS) celle16. Mens PSC-avledede organoider utnytter mekanismene for organutvikling for etableringen, kan ASC-er tvinges til å danne organoider ved å gjenoppbygge forhold som etterligner stamcellenisjen under fysiologisk vev selvfornyelse eller vevsreparasjon. PSC-avledede organoider er gunstige modeller for å utforske utvikling og organogenese, om enn ikke i stand til å nå det sammenlignbare modningsnivået til ASC-avledede organoider. Fosterlignende modningsstatus for PSC-avledede organoider, og kompleksitet for å etablere disse organoidene forhindrer betydelig deres brede anvendelser for å studere biologi og patologi i modne vev.
Den menneskelige luftveiene, fra nese til terminal bronkiol, er foret med luftveisepitelet, også kalt pseudostratifisert ciliated epitel, som består av fire store celletyper, det vil si ciliated celle, begercelle, basalcelle og klubbcelle. Vi etablerte den ASC-avledede humane lungeorganoiden fra humant lungevev i samarbeid med Clevers’ lab12,13. Disse lungeorganoidene utvides fortløpende i ekspansjonsmediet i over et år; den nøyaktige varigheten varierer mellom ulike organoidlinjer hentet fra forskjellige givere. Men sammenlignet med det opprinnelige luftveisepitelet, er disse langsiktige utvidbare lungeorganoidene ikke modne nok siden ciliated celler, den store cellepopulasjonen i den menneskelige luftveien, er underrepresentert i disse lungeorganoidene. Dermed utviklet vi en proksimal differensieringsprotokoll og genererte 3D- og 2D-luftveisorganoider som morfologisk og funksjonelt fenokopierer luftveisepitelet til et nesten fysiologisk nivå.
Her gir vi en videoprotokoll for å utlede humane lungeorganoider fra det primære lungevevet, utvide lungeorganoidene og indusere proksimal differensiering for å generere 3D- og 2D-luftveisorganoider.
Protocol
Representative Results
Discussion
De menneskelige luftveiene er foret med luftveisepitelet, også kjent som pseudostratifisert ciliated epitel. De viktigste celletypene av det øvre luftveisepitelet er ciliated celler som gjør det mulig for koordinert bevegelse av deres apikale cilia å utvise slim og inhalerte partikler fra luftveiene, begerceller som produserer og utskiller slim og basale celler som ligger i kjellermembranen og er involvert i regenerering. I den lille luftveien som bronkioler inneholder det cuboidale luftveisepitelet sekretoriske klub…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Center of PanorOmic Sciences and Electron Microscope Unit, Li Ka Shing Faculty of Medicine, University of Hong Kong, for hjelp til konfektavbildning og strømningscytometri. Dette arbeidet ble delvis støttet av midler fra Health and Medical Research Fund (HMRF, 17161272 og 19180392) fra Food and Health Bureau; Forskningsrådets generelle forskningsfond (GRF, 17105420). og Health@InnoHK, innovasjons- og teknologikommisjonen, regjeringen i Hong Kongs spesielle administrative region.
Materials
| Reagents for lung organoid culture | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | – |
| A8301 | Tocris | 2939 | 500nM |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 1x |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2) | Trevigen | 3533-010-0 | 70-80% |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
| GlutaMAX (glutamine) | Invitrogen | 35050061 | 1x |
| HEPES 1M | Invitrogen | 15630-056 | 10 mM |
| Heregulin β-1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Noggin (conditional medium) | home made | – | 10x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen | 15140-122 | 1x |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
| Rspondin1 (conditional medium) | home made | – | 10x |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | 1 µM |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 µM |
| Proximal differentiation medium | |||
| DAPT | Tocris | 2634 | 10 µM |
| Heparin Solution | StemCell Technology | 7980 | 4 µg/mL |
| Hydrocortisone Stock Solution | StemCell Technology | 7925 | 1 µM |
| PneumaCult-ALI 10X Supplement | air liquid interface supplement | ||
| PneumaCult-ALI Basal Medium | StemCell Technology | 05001 | air liquid interface basal medium |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement | air liquid interface maintenance supplement | ||
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 10 µM |
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | Baker | 1-800-992-2537 | |
| Carl Zeiss LSM 780 or 800 | Zeiss | confocal microscope | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 42093483 | |
| Stereo-microscope | Olympus Corporation | CKX31SF | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418BG040397 | |
| Serological pipettor | Eppendorf | ||
| Micropipette | Eppendorf | ||
| ZEN black or ZEN blue software | Zeiss | analysis software | |
| Consumables | |||
| 12mm Trans-well | StemCell Technology | #38023 | |
| 12-well cell culture plate | Cellstar | 665970 | |
| 15- and 50 ml conical tubes | Thermo Fisher Scientific | L6BF5Z8118 | |
| 24-well cell culture plate | Cellstar | 662160 | |
| 6.5mm Trans-well | StemCell Technology | #38024 | |
| Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Sigma-Aldrich | SLGPR33RB | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | ||
| Micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | TFLR140-200-Q21190531 | |
| Pasteur pipette glass | Thermo Fisher Scientific | 22-378893 | |
| Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml) | Thermo Fisher Scientific | BA08003, 08004, 08005 | |
| Antibodies | |||
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11007 | |
| Mouse Anti-Cytokeratin 5 | Abcam | ab128190 | |
| Mouse Anti-FOX J1 | Invitrogen | 14-9965-82 | |
| Mouse Anti-Mucin 5AC | Abcam | ab3649 | |
| Mouse Anti-β-tubulin 4 | Sigma | T7941 | |
| Rabbit Anti-p63 | Abcam | ab124762 | |
| Rat Anti-Uteroglobin/CC-10 | R&D Systems | MAB4218-SP | |
| Other reagent | |||
| TrypLE Select Enzyme (10X) | Thermo Fisher Scientific | A1217701 | dissociation enzyme |
References
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).
- Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Wroblewski, L. E., et al. Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells. Gut. 64 (5), 720-730 (2015).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Zhou, J., et al. Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Lancaster, M. A., Huch, M. Disease modelling in human organoids. Disease Model Mechanisms. 12 (7), (2019).
- . Millicell ERS-2 User Guide Available from: https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5 (2021)
- Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. eLife. 4, 05098 (2015).
- Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells. Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).
- Glinka, A., et al. LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling. EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).
- Groppe, J., et al. Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin. Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).
- Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors. Development. 143 (5), 764-773 (2016).
- Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
- Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation. Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).
- Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids in immunological research. Nature Reviews. Immunology. 20 (5), 279-293 (2019).
- Drost, J., Clevers, H. Translational applications of adult stem cell-derived organoids. Development. 144 (6), 968-975 (2017).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Zhou, J., et al. Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2. Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).
- Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
- Han, Y., et al. Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids. Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).
- Mykytyn, A. Z., et al. SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site. eLife. 10, 64508 (2021).
- Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
- Lamers, M. M., et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369 (6499), 50-54 (2020).
- Mallapaty, S. The mini lungs and other organoids helping to beat COVID. Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).
