Purification et identification de protéines spécifiques de type cellulaire à partir de tissus complexes à l’aide d’une lignée de souris mutante d’ARNt synthétase de méthionine
Summary
Ce protocole décrit comment effectuer le marquage de protéines spécifiques au type cellulaire avec l’azidonorleucine (ANL) à l’aide d’une lignée de souris exprimant une synthétase d’ARNt L274G-méthionine mutante (MetRS*) et les étapes nécessaires pour isoler des protéines marquées spécifiques au type cellulaire. Nous décrivons deux voies d’administration possibles d’ANL chez des souris vivantes par (1) l’eau potable et (2) les injections intrapéritonéales.
Abstract
Comprendre l’homéostasie des protéines in vivo est essentiel pour savoir comment les cellules fonctionnent dans des conditions physiologiques et pathologiques. Le présent protocole décrit le marquage in vivo et la purification ultérieure de protéines nouvellement synthétisées à l’aide d’une lignée de souris modifiée pour diriger le marquage des protéines vers des populations cellulaires spécifiques. Il s’agit d’une lignée inductible par l’expression de la Cre recombinase de L274G-Methionine tRNA synthetase (MetRS*), permettant l’incorporation d’azidonorleucine (ANL) aux protéines, ce qui ne se produirait pas autrement. En utilisant la méthode décrite ici, il est possible de purifier des protéomes spécifiques au type cellulaire marqués in vivo et de détecter des changements subtils dans la teneur en protéines dus à la réduction de la complexité de l’échantillon.
Introduction
L’homéostasie protéique aberrante est causée par un déséquilibre dans la synthèse et la dégradation des protéines. Plusieurs maladies sont liées à des altérations de l’homéostasie des protéines. La caractéristique de certaines maladies est la présence d’agrégats dans différents endroits subcellulaires et zones du cerveau. L’homéostasie des protéines est non seulement importante dans la maladie, mais joue également un rôle crucial dans la fonction organique et cellulaire normale1. Par exemple, la synthèse des protéines est nécessaire pour de nombreuses formes de plasticité neuronale2,3, telle que déterminée par l’utilisation d’inhibiteurs chimiques qui bloquent la synthèse des protéines4. Cependant, il n’est pas clair dans quels types de cellules le protéome est modifié pour soutenir l’apprentissage et la mémoire, ni quelles protéines spécifiques dans chaque type cellulaire augmentent ou diminuent dans leur synthèse ou leur dégradation. Ainsi, une étude approfondie de l’homéostasie des protéines nécessite la capacité de différencier les protéomes provenant de types cellulaires spécifiques. En effet, l’identification de protéomes spécifiques au type cellulaire pour étudier les processus cellulaires se produisant dans un environnement multicellulaire a été un obstacle important en protéomique. Pour cette raison, nous avons développé une technique utilisant l’expression MetRS* combinée à des méthodes bio-orthogonales qui s’est avérée être un moyen efficace d’identifier et de purifier des protéomes spécifiques de type cellulaire, comblant cette lacune 5,6,7.
L’expression d’un mutant MetRS* (MetRS L274G) permet le chargement de l’analogue non canonique de la méthionine ANL dans l’ARNt 8,9 correspondant et son incorporation ultérieure dans les protéines. Lorsque l’expression de MetRS* est régulée par un promoteur spécifique au type cellulaire, l’acide aminé non canonique sera incorporé dans les protéines de manière sélective des cellules. Une fois que l’ANL est incorporée dans les protéines, elle peut être fonctionnalisée sélectivement par la chimie du clic et ensuite visualisée par imagerie (FUNCAT) ou par Western Immunoblot (BONCAT). Alternativement, les protéines peuvent être purifiées sélectivement et identifiées par spectrométrie de masse (MS). Grâce à cette technologie, nous avons créé une lignée de souris exprimant la protéine MetRS* sous le contrôle de la Cre recombinase. Compte tenu du nombre croissant de lignées Cre-mouse disponibles, le système MetRS* peut être utilisé dans n’importe quel domaine pour étudier n’importe quel type de cellule à partir de n’importe quel tissu pour lequel il existe une Cre-line. Le marquage des protéines avec ANL est possible in vitro ou in vivo, et ne modifie pas le comportement de la souris ou l’intégrité des protéines6. La durée de marquage peut être adaptée à la question scientifique de chaque chercheur, en marquant des protéines nouvellement synthétisées (temps de marquage plus courts) ou des protéomes entiers (temps de marquage plus longs). L’utilisation de cette technique est limitée par le nombre de cellules du type que le chercheur est prêt à étudier; Par conséquent, l’isolement des protéines à partir de types cellulaires à faible nombre ou à faible taux métabolique n’est pas possible par cette méthode. L’objectif de la méthode présentée est d’identifier des protéines/protéomes spécifiques au type cellulaire marqués in vivo. Dans ce protocole, nous décrivons comment marquer des protéomes spécifiques au type cellulaire avec ANL chez des souris vivantes et purifier les protéines marquées. Après purification, les protéines peuvent être identifiées par des protocoles de spectrométrie de massede routine 5,10. La réduction de la complexité de l’échantillon obtenue dans cette méthode par la purification sélective de protéines provenant de populations cellulaires spécifiques permet à l’expérimentateur de détecter des changements subtils dans les protéomes, par exemple, en réponse à des changements environnementaux. La purification des protéines marquées peut être réalisée en ~10 jours, sans compter l’analyse MS ou la période de marquage. Ici, nous décrivons deux méthodes d’administration d’ANL à des souris exprimant MetRS*, à savoir (1) l’ajout d’acide aminé dans l’eau potable et (2) l’introduction de LNA par injections intrapéritonéales. Quelle que soit la méthode choisie pour l’administration de l’ANL, les étapes d’isolement et de purification sont les mêmes (à partir de l’étape 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Les aspects critiques du protocole sont les suivants : l’inclusion de témoins négatifs, ayant suffisamment de réplicats biologiques, la voie d’administration ANL, la quantité et la durée, l’alkylation des échantillons, la concentration d’alcyne et l’élimination du β-mercaptoéthanol lors de l’utilisation de DST-alcyne.
Il est essentiel d’inclure des échantillons témoins négatifs provenant d’animaux marqués ANL sans pilote Cre et donc sans expression MetRS*. Ces éch…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
B.A-C est financé par le ministère espagnol de la Science et de l’Innovation (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), par la Communauté autonome de Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057) et par les subventions MICINN (PID2020-113270RA-I00). R. A-P est financé par la Communauté autonome de Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057). E.M.S. est financé par la Société Max Planck, une bourse de chercheur avancé du Conseil européen de la recherche (subvention 743216), DFG CRC 1080: Mécanismes moléculaires et cellulaires de l’homéostasie neurale, et DFG CRC 902: Principes moléculaires de régulation basée sur l’ARN. Nous remercions D.C Dieterich et P. Landgraf pour leurs conseils techniques et la synthèse du DST-Alcyne. Nous remercions E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast et l’animalerie du MPI for Brain Research pour leur excellent soutien. Nous remercions Sandra Goebbels d’avoir partagé la gamme de souris Nex-Cre. Nous remercions Antonio G. Carroggio pour son aide avec l’édition anglaise. B.A-C. conçu, mené et analysé des expériences. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E. et S. t. D. a mené et analysé des expériences. B.A-C et E.M.S. ont conçu des expériences et supervisé le projet, B.A-C a écrit l’article. Tous les auteurs ont édité l’article.
Materials
| 12% Acrylamide gels | GenScript | SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12% | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood |
| ANL | Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11) | ||
| ANL-HCl | IrishBotech | HAA1625.0500 | |
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Biotin alkyne | Thermo, | B10185 | |
| Chicken antibody anti-GFP | Aves | 1020 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor | Roche | 4693132001 | Toxic; use a lab coat and gloves. |
| Copper (I) bromide | Sigma | 254185 | 99.999% (wt/wt) |
| Disulfide tag (DST)-alkyne | Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20 | ||
| DMSO | Sigma | 276855 | |
| Filters | Merk | SCGP00525 | |
| Iodo acetamide (IAA) | Sigma | I1149 | |
| IR anti chicken 800 | LI-COR | IRDye 800CW | Donkey anti-Chicken Secondary Antibody |
| IR anti rabit 680 | LI-COR | IRDye 680RD | Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody |
| Maltose | Sigma | M9171 | |
| Manual Mixer | BioSpec Products | 1083 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | 4259 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| NeutrAvidin beads | Pierce | 29200 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 1620112 | |
| PBS 1X | Thermo | J62036.K2 | |
| PBS 1X pH 7.8 | Preparation described in reference number 5 | ||
| PD SpinTrap G-25 columns | GE Healthcare | Buffer exchange | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo, | 23225 | Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life. |
| Polyclonal rabbit anti-biotin antibody | Cell Signaling | 5597 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| SDS 10% | Sigma | 71736 | |
| SDS-PAGE Running buffer MOPS | GenScript | M00138 | |
| SYPRO Ruby stain | Sigma | S4942 | |
| Table automatic Vortexer | Eppendorf | Mixmate | |
| Triazole ligand | Sigma | 678937 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Water | Sigma | W4502 | Molecular biology grade |
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