Summary

인간 탯줄 조직에서 중간엽 줄기 세포의 생성과 골격근 계보로의 분화

Published: August 31, 2022
doi:

Summary

우리는 인간 탯줄 조직으로부터 중간엽 줄기 세포를 분리하고 골격근 혈통으로의 분화를 위한 프로토콜을 기술한다.

Abstract

중간엽 줄기 세포의 치료 잠재력을 탐구하는 것은 분리의 용이성, 분화에 대한 효능 및 공급원의 신뢰성과 견고성에 달려 있습니다. 우리는 인간 탯줄 조직 (uMSCs)으로부터 중간엽 줄기 세포의 단리, 그들의 면역 표현형, 및 여러 계대에 걸쳐 그러한 배양물의 전파를 위한 단계적 프로토콜을 여기에서 설명한다. 이 절차에서 uMSCs의 생존력은 효소 소화가 없기 때문에 높습니다. 또한, 탯줄 동맥과 정맥을 포함한 혈관을 제거하면 내피 기원의 세포가 오염되지 않도록합니다. 유세포 분석기를 사용하여, 단리시 uMSC는 CD45-CD34이며, 이는 조혈 혈통으로부터 세포의 부재를 나타낸다. 중요하게도, 이들은 키 표면 마커, CD105, CD90 및 CD73을 발현한다. 배양물의 확립시, 이 논문은 이들 uMSCs에서 골격근 계통으로의 분화를 유도하는 효율적인 방법을 기술한다. 분화된 uMSCs에서의 근인성 진행에 대한 상세한 분석은 uMSCs가 분화의 초기 단계에서 근인성 선조에 대한 마커인 Pax7을 발현하고, 이어서 MyoD 및 Myf5의 발현, 그리고 마지막으로 말단 분화 마커인 미오신 중쇄(MyHC)를 발현한다는 것을 밝혀낸다.

Introduction

인간 탯줄은 강력한 증식 및 분화 속도, 면역 조절 특성 및 세 배아층 모두에서 세포를 생성하는 능력으로 인해 재생 요법을 위해 현재 탐구되고있는 중간엽 줄기 세포의 견고한 저장소를 보유하고있는 것으로 인정 받고 있습니다1. 탯줄 조직은 탯줄 혈, 탯줄 정맥 내피 및 와튼 젤리 (WJ)와 같은 여러 구획으로 구성되며, 그 자체로 혈관 주위 영역, 혈관 간 영역 및 양막 하부 또는 코드 라이닝 (CL)2의 세 가지 불분명 한 영역을 포함합니다. uMSCs가 이러한 모든 상이한 영역으로부터 단리되고 주요 MSC 마커를 광범위하게 발현할 수 있지만, 이들 구획이 uMSCs의 동일한 집단을 포함하는지 또는 그들의 분화 효능에서 차이를 나타내는지에 대한 명확성은 없다3. 따라서 uMSC의 분리를 위한 프로토콜은 격리 모드 및 영역에서 더 높은 정밀도, 차별화 전위의 강력한 특성화, 그리고 마지막으로 코드의 다른 구획으로부터의 비교 분석이 필요합니다.

이러한 맥락에서, 탯줄의 다른 부분 사이의 uMSC 증식 및 분화 잠재력의 차이를 입증 한 연구는 거의 없습니다. 이들 중, CL 및 WJ 영역으로부터 분리된 uMSCs 사이의 비교 분석은 CL 유래 uMSCs 3,4에서 더 큰 증식 가능성을 나타냈다. 별도의 연구에서, WJ 유래 uMSCs는 혈관주위 세포 (HUCPV)5에 비해 증식 분석에서 더 잘 수행되었다. 혈관 오염이 없는 제대혈 유래 uMSCs와 탯줄 조직 유래 uMSCs 사이의 차이를 조사함에 있어서, 주요 MSC 마커의 차등적 발현은 두 구획 사이에서 보고되었고, 탯줄 조직 유래 uMSCs6에서 증식 속도 증가가 보고되었다.

uMSCs의 분화 가능성을 주로 골형성, 지방형성 및 연골 혈통과 같은 중배엽 혈통의 조직으로 조사하는 여러 연구 중 극소수만이 근인성 분화 및 후속 특성화에 대한 상세한 프로토콜뿐만 아니라 다양한 탯줄 구획 간의 비교 분석을 제공했습니다. 이러한 맥락에서, 우리는 강력한 근육 분화 프로토콜을 개발하여 탯줄 조직 유래 uMSC가 제대혈6에 비해 우수한 근형성 분화 능력을 나타낸다는 것을 관찰했다. 여기서, 단계적 프로토콜은 혈관구조와 관련된 세포가 결여된 전체 탯줄 조직으로부터 uMSCs의 단리, 이들의 특성화, 및 근인성 계보로의 이들의 분화에 대해 상세히 기술되어 있다.

Protocol

이 연구에서 탯줄 조직의 사용은 줄기 세포 연구 기관위원회 (IC-SCR), 기관 윤리위원회, 번역 건강 과학 기술 연구소 (IEC-THSTI), 민간 병원의 기관 윤리위원회, Gurugram, Haryana 및 기관 생물 안전위원회, THSTI에 의해 승인되었습니다. 인간 탯줄 조직 샘플은 출생시의 용어 전달로부터 수확되었다. 피험자로부터 정보에 입각한 서면 동의를 얻었다. 모든 방법은 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다.</…

Representative Results

탯줄 조직에서 uMSCs의 분리의 성공은 전체 제대혈에서 성공의 가난한 비율과 달리 >95 %입니다. uMSCs의 성공적인 단리시, FACS 분석은 모든 세포가 CD34-CD45-CD105+CD90+임을 밝혀내었다. 그러나, 비교 분석에서, 제대혈로부터 분리된 uMSCs는 이종 집단을 표시하며, 여기서 세포의 비율은 CD34+CD45+CD105+(~15%)를 나타낸다. 추가적으로, 이중 양성 CD105+<…

Discussion

중요한 단계
이 프로토콜의 중요한 단계는 전달 시점부터 멸균 배양물의 유지에 이르기까지 전파의 전체 기간 동안 무균 조건 하에서 조직을 수집하는 것입니다. 코드 수집 중에 탯줄은 살균되지 않은 표면에 닿지 않고 항생제가 보충 된 PBS가 함유 된 튜브에 수집하기 전에 70 % 에탄올로 외부에서 면도하는 것이 중요합니다. uMSC 단리를 위한 탯줄 수집과 조직의 처리 사이의 시간을 …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

촬영 및 비디오 제작에 도움을 주신 Ojas Tikoo 씨에게 감사드립니다. 우리는 또한 GARBH-Ini (Advanced Research and Birth Outcome-DBT India)의 직원, 간호사 및 Gurugram Civil Hospital의 선임 연구원 및 Pallavi Kshetrapal 박사로부터 물류에 대한 도움을받은 도움을 인정합니다. 이 작업은 인도 생명 공학부의 Suchitra Gopinath에게 수여 된 보조금으로 지원되었습니다 (BT / 09 / IYBA / 2015; BT / PR29599 / PFN / 20 / 1393 / 2018).

Materials

4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific D1306
Amphotericin B Sigma Aldrich A2411
Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) HiMedia A001A-50mL
Anti-GAPDH antibody Sigma Aldrich G8795
Anti-MyHC antibody (My32) Novus Biologicals NBP2-50401AF647
Anti-MyoD antibody (5.8A) Novus Biologicals NB100-56511
Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) Novus Biologicals NBP2-34616AF594
Anti-Pax7 antibody DSHB DSHB-C1-576
APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 BD Biosciences 559869
Collagen Type 1 Merck C8919
D (+) Glucose Sigma Aldrich G7021
Dexamethasone SIGMA D4902
FACSCanto II or FACSAria III BD Biosciences
Fetal Bovine Serum, qualified Brazil GIBCO 10270106 not to be heat-inactivated
FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 BD Biosciences 551146
FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 BD Biosciences 557153
FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 BD Biosciences 557508
FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 BD Biosciences 555821
FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 BD Biosciences 555482
FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 BD Biosciences 560840
FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 BD Biosciences 555595
FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 BD Biosciences 557348
FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 BD Biosciences 555786
FlowJo software BD Biosciences
Gentamicin Sigma Aldrich G1264
Horse serum HiMedia RM1239
Hydrocortisone Merck H4001
Laminin Merck L2020
MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides Hyclone SH30568.FS Basal medium for uMSCs
PE Mouse anti-human CD105 clone 266 BD Biosciences 560839
PE Mouse anti-human CD44 clone 515 BD Biosciences 550989
PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 BD Biosciences 555617
PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 BD Biosciences 555787
PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 BD Biosciences 561258
Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 HiMedia M1866
Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) HiMedia TCL049-100mL

References

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Citer Cet Article
Sevak, J. K., Gopinath, S. D. Generation of Mesenchymal Stem Cells from Human Umbilical Cord Tissue and their Differentiation into the Skeletal Muscle Lineage. J. Vis. Exp. (186), e63725, doi:10.3791/63725 (2022).

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