Massa-opfok en moleculaire studies in Tortricidae plaaginsecten
Summary
Het huidige protocol beschrijft de kweekmethode van tortricid plaaginsecten in de laboratoria. De procedures om het geslacht van insecten te onderscheiden en nucleïnezuren te extraheren voor sequencing met hoge doorvoer worden vastgesteld met behulp van twee tortricid-plagen.
Abstract
Tortricidae (Lepidoptera), algemeen bekend als tortrix of bladrollermotten, bevat veel land- en bosbouwplagen, die ernstige landbouwverliezen veroorzaken. Om de biologie van dergelijke plaagmotten te begrijpen, zijn fundamentele technieken erg in trek geweest. Hier worden methoden voor massa-opfok, observaties en moleculaire studies ontwikkeld met behulp van twee theetort, Homona magnanima en Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae). Insecten werden massaal gekweekt met gesneden kunstmatig dieet en onderhouden door inteelt gedurende meer dan 100 generaties door rekening te houden met hun biologische kenmerken. Insecten hebben verschillende geslachtsdimorfismen; daarom is het moeilijk om het geslacht te onderscheiden tijdens de ontwikkelingsstadia, die latere assays hebben voorkomen. Het huidige werk benadrukte dat het geslacht van tortricidslarven kon worden bepaald door testikels of melk-azijnachtige orceïnekleuring te observeren om het vrouwspecifieke W-chromosoom te visualiseren. Bovendien maakte de huidige studie, met behulp van de geslachtsbepalingsmethoden, nucleïnezuurextracties uit geslachtsbepaalde embryo’s en toepassing op high throughput sequencing mogelijk. Deze tips zijn toepasbaar op andere plaaginsecten en zullen verdere morfologische en genetische studies vergemakkelijken.
Introduction
Lepidopteran insecten vertegenwoordigen meer dan 10% van alle beschreven levende soorten1, en bepaalde taxa soorten veroorzaken ernstige schade aan planten en ernstige landbouwverliezen 2,3. Hoewel moleculaire en genetische studies zijn ontwikkeld met behulp van modelinsecten zoals de zijderups Bombyx mori 4,5, blijven plaaginsecten onbeproefd, mede vanwege de moeilijkheden voor het fokken en hanterenvan 6,7. Daarom zijn fundamentele studies en technieken nodig om de biologie van dergelijke niet-model plaaginsecten te begrijpen.
De Tortricidae (Lepidoptera), algemeen bekend als tortrix of bladrollermotten, omvat veel land- en bosbouwplagen8. Van de insectentaxa zijn de oosterse theeschildpad Homona magnanima Diakonoff en de zomerfruittort Adoxophyes honmai Yasuda ernstige polyfagote plagen waarvan bekend is dat ze theebomen in Oost-Azië beschadigen7. De twee soorten leggen platte en ovale schubachtige eierclusters (of eimassa’s) bestaande uit dunne, zachte en fragiele eieren bedekt met maternale afscheidingen. Hoewel embryogenesestadia cruciaal zijn voor de ontwikkeling van insecten en geslachtsbepalingen9, verhinderen structuren van de eieren verdere analyse om de biologie van de insecten te begrijpen. Het is belangrijk om de moeilijkheden te overwinnen voor verder onderzoek naar plagen die zo’n complexe eimassa verankeren.
Hier, om de biologie van tortriciden te begrijpen, zijn methoden voor massa-opfok, observaties en moleculaire studies ontwikkeld met behulp van A. honmai en H. magnanima. Ten eerste onderhouden massafokmethoden beide tortriciden gedurende 100 generaties door inteelt. De scheiding van eieren van de aaneengeschakelde schubachtige eimassa vergemakkelijkte embryogenese-observatie van de tortriciden met behulp van alkalische en organische oplosmiddelen die eerder waren ontwikkeld op basis van technieken die bij vliegenwerden gebruikt 10. Bovendien stelde de huidige studie geslachtsdiscriminatie van kleine embryo’s vast door kleuringsmethoden van het geslachtschromatine van lepidoptera-vrouwtjes te ontwikkelen met behulp van melkzuur-azijn orceïne11. Door deze methoden te combineren, werden nucleïnezuren van hoge kwaliteit en kwantiteit geëxtraheerd uit geslachtsbepaalde embryo’s, wat anders moeilijk vast te stellen was6. Het geëxtraheerde RNA werd gebruikt voor sequencing van de volgende generatie. Gezamenlijk zijn de hier gepresenteerde methoden van toepassing op andere lepidoptera-insecten en andere insectentaxa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tortricid bestaat uit verschillende land- en bosbouwplagen; de huidige studie presenteerde methoden om tortrix generaties lang te kweken, embryogenese en geslacht van de insecten te observeren en moleculaire analyse uit te voeren met behulp van gerijpte embryo’s.
Een van de obstakels voor ongedierte-insectenstudie is het vaststellen van opfokmethoden. Vooral inteelt heeft soms een negatieve invloed op de fitheid van de soort. De fitheidsvermindering door de inteelt, inteeltdepressie genaamd, i…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen de steun van de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Research Fellowships for Young Scientists erkennen [Grant Number 19J13123 and 21J00895].
Materials
| 1/2 ounce cup | FP CHUPA | CP070009 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010417/ |
| 1/2 ounce cup lid | FP CHUPA | CP070011 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether |
| 99.7% acetic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 36289 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument |
| Agilent RNA6000 nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG |
| benzalkonium chloride solution | Nihon Pharmaceutical Co., Ltd | No.4987123116046 | Sterilization; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html |
| Cotton | AOUME | 8-1611-02 | insect rearing; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1 |
| DAPI solution | Dojindo, Tokyo, Japan | 340-07971 | stainings; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/ |
| Disodium Hydrogenphosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html |
| dsDNA HS quantification kit | Invitrogen | Q33231 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230 |
| Econospin RNA II column | Epoch Life Science Inc. | EP-11201 | RNA extraction; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx |
| Ethanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Tetrasodium Salt Tetrahydrate (4NA) | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html |
| Glassine paper | HEIKO | 2100010 | insect rearing; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla& utm_medium=cpc&utm_source= Adw |
| heat block WSC-2620 PowerBLOCK | ATTO, Tokyo, Japan | 4002620 | incubation; https://www.attoeng.site/ |
| heptane | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html |
| INSECTA LF | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| ISOGENII | Nippon Gene | 311-07361 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html |
| isopropanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | nucleic acids extraction; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html |
| Lactic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html |
| methanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html |
| MSV-3500 vortex | Biosan | BS-010210-TAK | Voltex mixer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/ |
| Nano Photometer NP 80 | Implen | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/ |
| Natural pack wide | Inomata chemical | 1859 | insect rearing; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3%82%A4%E3%83%89 |
| NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7770S | Library preparation; https://www.nebj.jp/products/detail/2039 |
| orcein | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html |
| Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 160-16061 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html |
| Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength) | Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan | not shown | Insect collection; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328 |
| Potassium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen, MA, USA | P36965 | antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965 |
| Proteinase K Solution | Merck | 71049-4CN | DNA extraction; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049 |
| protein precipitation solution | Qiagen | 158912 | DNA extraction; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC |
| Qubit V4 | Invitrogen | Q33238 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238 |
| rifampicin | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html |
| RNA HS quantification kit | Invitrogen | Q32855 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852 |
| RNase solution | Nippon Gene | 313-01461 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html |
| Silk Mate 2S | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| Sodium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html |
| Sodium Dodecyl Sulfate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html |
| sodium hypochlorite aqueous solution | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | egg separation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html |
| Tetracycline Hydrochloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html |
| Tris-HCl | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html |
| ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977023 | RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015 |
References
- Gaston, K. J. The magnitude of global insect species richness. Conservation Biology. 5 (3), 283-296 (1991).
- Pogue, M. A world revision of the genus Spodoptera Guenée (Lepidoptera: Noctuidae). Memoirs of the American Entomological Society. 43, 1 (2002).
- Matsuura, H., Naito, A. Studies on the cold-hardiness and overwintering of Spodoptera litura F. (Lepidoptera: Noctuidae): VI. Possible overwintering areas predicted from meteorological data in Japan. Applied Entomology and Zoology. 32 (1), 167-177 (1997).
- Mita, K., et al. The construction of an EST database for Bombyx mori and its application. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 14121-14126 (2003).
- Kawamoto, M., et al. High-quality genome assembly of the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 107, 53-62 (2019).
- Fukui, T., et al. In vivo masculinizing function of the Ostrinia furnacalis Masculinizer gene. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (3), 1768-1772 (2018).
- Arai, H., Ishitsubo, Y., Nakai, M., Inoue, M. N. A simple method to disperse eggs from lepidopteran scale-like egg masses and to observe embryogenesis. Entomological Science. 25 (1), 12497 (2022).
- vander Geest, L. P., Evenhuis, H. H. . Tortricid pests: their biology, natural enemies and control. , (1991).
- Kiuchi, T., et al. A single female-specific piRNA is the primary determiner of sex in the silkworm. Nature. 509 (7502), 633-636 (2014).
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40 (11), 792-804 (2010).
- Kageyama, D., Traut, W. Opposite sex-specific effects of Wolbachia and interference with the sex determination of its host Ostrinia scapulalis. Proceedings of the Royal Society B. 271 (1536), 251-258 (2004).
- Arai, H., Lin, S. R., Nakai, M., Kunimi, Y., Inoue, M. N. Closely related male-killing and nonmale-killing Wolbachia strains in the oriental tea tortrix Homona magnanima. Microbial Ecology. 79 (4), 1011-1020 (2020).
- Schalamun, M., et al. Harnessing the MinION: An example of how to establish long-read sequencing in a laboratory using challenging plant tissue from Eucalyptus pauciflora. Molecular Ecology Resources. 19 (1), 77-89 (2019).
- Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. Why does insect RNA look degraded. Journal of Insect Science. 10 (1), 159 (2010).
- Ivey, C. T., Carr, D. E., Eubanks, M. D. Effects of inbreeding in Mimulus guttatus on tolerance to herbivory in natural environments. Ecology. 85 (2), 567-574 (2004).
- Saccheri, I., et al. Inbreeding and extinction in a butterfly metapopulation. Nature. 392 (6675), 491-494 (1998).
- Crnokrak, P., Roff, D. A. Inbreeding depression in the wild. Heredity. 83 (3), 260-270 (1999).
- Keller, L. F., Waller, D. M. Inbreeding effects in wild populations. Trends in Ecology & Evolution. 17 (5), 230-241 (2002).
- Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell. Journal of Cell Science. 43 (1), 1-35 (1980).
- Sugimoto, T. N., Ishikawa, Y. A male-killing Wolbachia carries a feminizing factor and is associated with degradation of the sex-determining system of its host. Biology Letters. 8 (3), 412-415 (2012).
