कतरनी बलों द्वारा एन्सेंबल फोर्स स्पेक्ट्रोस्कोपी
Summary
एन्सेंबल फोर्स स्पेक्ट्रोस्कोपी (ईएफएस) बायोफिज़िकल और बायोसेंसिंग क्षेत्रों में बायोमोलेक्यूलर संरचनाओं के एक समूह के यांत्रिक प्रकटीकरण और वास्तविक समय संवेदन के लिए एक मजबूत तकनीक है।
Abstract
प्रतिदीप्ति और मेकेनोकेमिकल सिद्धांतों पर आधारित एकल-अणु तकनीक जैविक संवेदन में बेहतर संवेदनशीलता प्रदान करती है। हालांकि, उच्च थ्रूपुट क्षमताओं की कमी के कारण, इन तकनीकों का अनुप्रयोग बायोफिज़िक्स में सीमित है। एन्सेंबल फोर्स स्पेक्ट्रोस्कोपी (ईएफएस) ने अलग-अलग अणुओं के मेकेनोकेमिकल अध्ययनों को आणविक पहनावा में परिवर्तित करके आणविक संरचनाओं के एक विशाल सेट की जांच में उच्च थ्रूपुट का प्रदर्शन किया है। इस प्रोटोकॉल में, डीएनए द्वितीयक संरचनाओं (आई-रूपांकनों) को 77796 / सेकंड तक कतरनी दरों पर एक होमोजेनाइज़र टिप के रोटर और स्टेटर के बीच कतरनी प्रवाह में प्रकट किया गया था। आई-मोटिफ द्वारा अनुभव किए गए कतरनी बलों पर प्रवाह दर और आणविक आकार के प्रभाव ों का प्रदर्शन किया गया था। ईएफएस तकनीक ने डीएनए आई-रूपांकनों और लिगेंड के बीच बाध्यकारी संबंध का भी खुलासा किया। इसके अलावा, हमने एक क्लिक रसायन विज्ञान प्रतिक्रिया का प्रदर्शन किया है जिसे कतरनी बल (यानी, मेकानो-क्लिक रसायन विज्ञान) द्वारा सक्रिय किया जा सकता है। ये परिणाम आणविक संरचनाओं की रचना को नियंत्रित करने के लिए कतरनी बल का उपयोग करने की प्रभावशीलता स्थापित करते हैं।
Introduction
एकल-अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी1 (एसएमएफएस) में, व्यक्तिगत आणविक संरचनाओं के यांत्रिक गुणों का अध्ययन परिष्कृत उपकरणों जैसे परमाणु बल माइक्रोस्कोप, ऑप्टिकल ट्वीज़र्स और चुंबकीय चिमटी 2,3,4 द्वारा किया गया है। बल पैदा करने/पता लगाने वाले सेटअपों या चुंबकीय चिमटी में छोटे क्षेत्र और लघु सेंट्रीफ्यूज बल माइक्रोस्कोप (एमसीएफ) 5,6,7,8 में अणुओं की समान दिशात्मकता आवश्यकता द्वारा प्रतिबंधित, एसएमएफएस का उपयोग करके एक साथ केवल सीमित संख्या में अणुओं की जांच की जा सकती है। एसएमएफएस का कम थ्रूपुट आणविक मान्यता क्षेत्र में इसके व्यापक अनुप्रयोग को रोकता है, जिसके लिए अणुओं के एक बड़े सेट की भागीदारी की आवश्यकता होती है।
कतरनी प्रवाह अणुओं के एक विशाल सेट पर बलों को लागू करने के लिए एक संभावित समाधान प्रदान करताहै। एक चैनल के अंदर तरल प्रवाह में, चैनल की सतह के जितना करीब होता है, प्रवाह दर10 धीमी होती है। इस तरह के प्रवाह वेग ढाल कतरनी तनाव का कारण बनता है जो सीमा की सतह के समानांतर होता है। जब एक अणु को इस कतरनी प्रवाह में रखा जाता है, तो अणु खुद को फिर से तैयार करता है ताकि इसकी लंबी धुरी प्रवाह दिशा के साथ संरेखित हो, क्योंकि कतरनी बल लंबी धुरी11 पर लागू होता है। इस पुन: अभिविन्यास के परिणामस्वरूप, एक ही प्रकार के सभी अणुओं (हैंडल के आकार और लंबाई) को एक ही कतरनी बल का अनुभव करते समय एक ही दिशा में संरेखित करने की उम्मीद है।
यह काम आणविक संरचनाओं के एक विशाल सेट पर कतरनी बल लगाने के लिए इस तरह के कतरनी प्रवाह का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, जैसा कि डीएनए आई-मोटिफ द्वारा उदाहरण दिया गया है। इस प्रोटोकॉल में, एक होमोजेनाइज़र टिप में रोटर और स्टेटर के बीच एक कतरनी प्रवाह उत्पन्न होता है। वर्तमान अध्ययन में पाया गया कि मुड़े हुए डीएनए आई-मोटिफ संरचना को 9724-97245 एस -1 की कतरनी दरों द्वारा प्रकट किया जा सकता है। इसके अलावा, एल 2 एच 2-4 ओटीडी लिगैंड और आई-मोटिफ के बीच 36 μM का पृथक्करण स्थिरांक पाया गया था। यह मान जेल शिफ्ट परख12 द्वारा मापा गया 31 μM के अनुरूप है। इसके अलावा, वर्तमान तकनीक का उपयोग आई-मोटिफ को प्रकट करने के लिए किया जाता है, जो एक क्लिक प्रतिक्रिया को उत्प्रेरित करने के लिए चेलेटेड कॉपर (आई) को उजागर कर सकता है। इस प्रकार यह प्रोटोकॉल उचित समय (30 मिनट से कम) में कम लागत वाले उपकरणों के साथ आई-मोटिफ संरचनाओं के एक बड़े सेट को प्रकट करने की अनुमति देता है। यह देखते हुए कि कतरनी बल तकनीक बल स्पेक्ट्रोस्कोपी के थ्रूपुट को काफी बढ़ाती है, हम इस तकनीक को एन्सेंबल फोर्स स्पेक्ट्रोस्कोपी (ईएफएस) कहते हैं। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य इस कतरनी बल-आधारित ईएफएस के आवेदन को सुविधाजनक बनाने के लिए प्रयोगात्मक दिशानिर्देश प्रदान करना है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल कतरनी बल द्वारा बायोमोलेक्यूलर संरचनाओं के एक समूह के प्रकटहोने की वास्तविक समय की जांच की अनुमति देता है। यहां प्रस्तुत परिणाम इस बात को रेखांकित करते हैं कि डीएनए…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध कार्य को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन [सीबीईटी-1904921] और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान [एनआईएच आर 01 सीए 236350] द्वारा एचएम तक समर्थित किया गया था।
Materials
| 3K MWCO Amicon | Millipore Sigma | ufc900324 | |
| Ascorbic acid | VWR | VWRC0143-100G | |
| Calfluor 488 azide | Click Chemistry Tools | 1369-1 | |
| CuCl | Thermo | ACRO270525000 | |
| Dispersion tip | Switzerland | PT-DA07/2EC-B101 | |
| DNA oligos | IDT | ||
| Dye | IDT | /5Cy5/ | |
| Fluorescence microscope | Janpan | Nikon TE2000-U | |
| Homogenizer | Switzerland | PT 3100D | |
| HPG | Santa Cruz Biotechnology | cs-295271 | |
| KCl | VWR | VWRC26760.295 | |
| MES | VWR | VWRCE169-500G | |
| Quencher | IDT | /3IAbRQSp/ | |
| TBTA | Tokyo Chemical Industry | T2993 | |
| Tris | VWR | VWRCE133-100G |
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