Ensemble Force Spectroscopie door Shear Forces
Summary
Ensemble force spectroscopy (EFS) is een robuuste techniek voor mechanische ontvouwing en real-time detectie van een ensemble set van biomoleculaire structuren in biofysische en biosensing velden.
Abstract
Single-molecule technieken op basis van fluorescentie en mechanochemische principes bieden superieure gevoeligheid in biologische detectie. Vanwege het gebrek aan hoge doorvoermogelijkheden is de toepassing van deze technieken echter beperkt in de biofysica. Ensemblekrachtspectroscopie (EFS) heeft een hoge doorvoer aangetoond bij het onderzoek van een enorme reeks moleculaire structuren door mechanochemische studies van individuele moleculen om te zetten in die van moleculaire ensembles. In dit protocol werden de secundaire DNA-structuren (i-motieven) ontvouwd in de schuifstroom tussen de rotor en stator van een homogenisatorpunt met schuifsnelheden tot 77796/s. De effecten van stroomsnelheden en moleculaire groottes op de schuifkrachten die het i-motief ervaart, werden aangetoond. De EFS-techniek onthulde ook de bindingsaffiniteit tussen DNA i-motieven en liganden. Bovendien hebben we een klikchemiereactie aangetoond die kan worden geactiveerd door schuifkracht (d.w.z. mechano-klikchemie). Deze resultaten stellen de effectiviteit vast van het gebruik van schuifkracht om de conformatie van moleculaire structuren te regelen.
Introduction
In single-molecule force spectroscopy1 (SMFS) zijn de mechanische eigenschappen van individuele moleculaire structuren bestudeerd door geavanceerde instrumenten zoals de atoomkrachtmicroscoop, optische pincetten en magnetisch pincetten 2,3,4. Beperkt door dezelfde directionaliteitseis van de moleculen in de krachtgenererende/detecterende opstellingen of het kleine gezichtsveld in een magnetisch pincet en de miniatuurcentrifugekrachtmicroscoop (MCF)5,6,7,8, kan slechts een beperkt aantal moleculen tegelijkertijd worden onderzocht met behulp van SMFS. De lage doorvoer van SMFS verhindert de brede toepassing ervan in het moleculaire herkenningsveld, wat de betrokkenheid van een grote set moleculen vereist.
Shear flow biedt een mogelijke oplossing om krachten toe te passen op een enorme set moleculen9. In een vloeistofstroom in een kanaal geldt: hoe dichter bij het kanaaloppervlak, hoe langzamer de stroomsnelheid10. Zo’n stroomsnelheidsgradiënt veroorzaakt schuifspanning die evenwijdig is aan het grensvlak. Wanneer een molecuul in deze afschuifstroom wordt geplaatst, heroriënteert het molecuul zich zodat de lange as uitlijnt met de stroomrichting, omdat de schuifkracht wordt uitgeoefend op de lange as11. Als gevolg van deze heroriëntatie wordt verwacht dat alle moleculen van hetzelfde type (grootte en lengte van de handgrepen) in dezelfde richting uitlijnen terwijl ze dezelfde schuifkracht ervaren.
Dit werk beschrijft een protocol om zo’n schuifstroom te gebruiken om schuifkracht uit te oefenen op een massieve set moleculaire structuren, zoals geïllustreerd door het DNA i-motief. In dit protocol wordt een schuifstroom gegenereerd tussen de rotor en de stator in een homogenisatorpunt. De huidige studie wees uit dat de gevouwen DNA i-motiefstructuur kon worden ontvouwd door schuifsnelheden van 9724-97245 s−1. Bovendien werd een dissociatieconstante van 36 μM gevonden tussen het L2H2-4OTD-ligand en het i-motief. Deze waarde komt overeen met die van 31 μM gemeten door de gelverschuivingstest12. Verder wordt de huidige techniek gebruikt om het i-motief te ontvouwen, dat het gechelateerde koper (I) kan blootstellen om een klikreactie te katalyseren. Dit protocol maakt het dus mogelijk om een grote set i-motiefstructuren met goedkope instrumenten in een redelijke tijd (korter dan 30 minuten) uit te vouwen. Aangezien de schuifkrachttechniek de doorvoer van de krachtspectroscopie drastisch verhoogt, noemen we deze techniek ensemblekrachtspectroscopie (EFS). Dit protocol heeft tot doel experimentele richtlijnen te geven om de toepassing van dit efs op basis van schuifkracht te vergemakkelijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol dat in dit manuscript wordt beschreven, maakt real-time onderzoek mogelijk van de ontvouwing van een ensembleset van biomoleculaire structuren door schuifkracht. De hier gepresenteerde resultaten onderstrepen dat DNA i-motiefstructuren kunnen worden ontvouwd door schuifkracht. Het ontvouwen van het ligandgebonden i-motief en de schuifkracht-aangedreven klikreacties waren proof-of-concept toepassingen voor deze ensemblekrachtspectroscopiemethode.
Figuur 1</stro…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoekswerk werd ondersteund door de National Science Foundation [CBET-1904921] en de National Institutes of Health [NIH R01CA236350] aan H.M.
Materials
| 3K MWCO Amicon | Millipore Sigma | ufc900324 | |
| Ascorbic acid | VWR | VWRC0143-100G | |
| Calfluor 488 azide | Click Chemistry Tools | 1369-1 | |
| CuCl | Thermo | ACRO270525000 | |
| Dispersion tip | Switzerland | PT-DA07/2EC-B101 | |
| DNA oligos | IDT | ||
| Dye | IDT | /5Cy5/ | |
| Fluorescence microscope | Janpan | Nikon TE2000-U | |
| Homogenizer | Switzerland | PT 3100D | |
| HPG | Santa Cruz Biotechnology | cs-295271 | |
| KCl | VWR | VWRC26760.295 | |
| MES | VWR | VWRCE169-500G | |
| Quencher | IDT | /3IAbRQSp/ | |
| TBTA | Tokyo Chemical Industry | T2993 | |
| Tris | VWR | VWRCE133-100G |
References
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Woodside, M. T., et al. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6190-6195 (2006).
- Grandbois, M., Beyer, M., Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. How strong is a covalent bond. Science. 283 (5408), 1727-1730 (1999).
- Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V. Behavior of supercoiled DNA. Biophysical Journal. 74 (4), 2016-2028 (1998).
- Yang, D., Ward, A., Halvorsen, K., Wong, W. P. Multiplexed single-molecule force spectroscopy using a centrifuge. Nature Communications. 7, 11026 (2016).
- Su, H., et al. Light-responsive polymer particles as force clamps for the mechanical unfolding of target molecules. Nano Letters. 18 (4), 2630-2636 (2018).
- Kirkness, M. W. H., Forde, N. R. Single-molecule assay for proteolytic susceptibility: Force-induced collagen destabilization. Biophysical Journal. 114 (3), 570-576 (2018).
- Astumian, R. D. Thermodynamics and kinetics of molecular motors. Biophysical Journal. 98 (11), 2401-2409 (2010).
- Bekard, I. B., Asimakis, P., Bertolini, J., Dunstan, D. E. The effects of shear flow on protein structure and function. Biopolymers. 95 (11), 733-745 (2011).
- Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).
- Hu, C., Jonchhe, S., Pokhrel, P., Karna, D., Mao, H. Mechanical unfolding of ensemble biomolecular structures by shear force. Chemical Science. 12 (30), 10159-10164 (2021).
- Sedghi Masoud, S., et al. Analysis of interactions between telomeric i-motif DNA and a cyclic tetraoxazole compound. ChemBioChem. 19 (21), 2268-2272 (2018).
- Abraham Punnoose, J., et al. Adaptive and specific recognition of telomeric G-quadruplexes via polyvalency induced unstacking of binding units. Journal of the American Chemical Society. 139 (22), 7476-7484 (2017).
- Dhakal, S., et al. Coexistence of an ILPR i-motif and a partially folded structure with comparable mechanical stability revealed at the single-molecule level. Journal of the American Chemical Society. 132 (26), 8991-8997 (2010).
- Hu, C., Tahir, R., Mao, H. Single-molecule mechanochemical sensing. Accounts of Chemical Research. 55 (9), 1214-1225 (2022).
