Espectroscopía de fuerza de conjunto por fuerzas de cizallamiento
Summary
La espectroscopia de fuerza de conjunto (EFS) es una técnica robusta para el despliegue mecánico y la detección en tiempo real de un conjunto de estructuras biomoleculares en campos biofísicos y biosensibles.
Abstract
Las técnicas de molécula única basadas en principios de fluorescencia y mecanoquímicos proporcionan una sensibilidad superior en la detección biológica. Sin embargo, debido a la falta de capacidades de alto rendimiento, la aplicación de estas técnicas es limitada en biofísica. La espectroscopia de fuerza de conjunto (EFS) ha demostrado un alto rendimiento en la investigación de un conjunto masivo de estructuras moleculares mediante la conversión de estudios mecanoquímicos de moléculas individuales en los de conjuntos moleculares. En este protocolo, las estructuras secundarias de ADN (i-motivos) se desplegaron en el flujo de corte entre el rotor y el estator de una punta homogeneizadora a velocidades de cizallamiento de hasta 77796 / s. Se demostraron los efectos de las tasas de flujo y los tamaños moleculares sobre las fuerzas de cizallamiento experimentadas por el i-motivo. La técnica EFS también reveló la afinidad de unión entre los i-motivos de ADN y los ligandos. Además, hemos demostrado una reacción química de clic que puede ser accionada por fuerza de cizallamiento (es decir, química de clic mecánico). Estos resultados establecen la efectividad del uso de la fuerza de cizallamiento para controlar la conformación de estructuras moleculares.
Introduction
En la espectroscopia de fuerza de molécula única1 (SMFS), las propiedades mecánicas de estructuras moleculares individuales han sido estudiadas por instrumentos sofisticados como el microscopio de fuerza atómica, pinzas ópticas y pinzas magnéticas 2,3,4. Restringido por el mismo requisito de direccionalidad de las moléculas en las configuraciones generadoras / de detección de fuerza o el pequeño campo de visión en pinzas magnéticas y el microscopio de fuerza centrífuga en miniatura (MCF)5,6,7,8, solo se puede investigar simultáneamente un número limitado de moléculas utilizando SMFS. El bajo rendimiento de SMFS impide su amplia aplicación en el campo del reconocimiento molecular, que requiere la participación de un gran conjunto de moléculas.
El flujo de cizallamiento proporciona una solución potencial para aplicar fuerzas a un conjunto masivo de moléculas9. En un flujo de líquido dentro de un canal, cuanto más cerca de la superficie del canal, más lento será el caudal10. Tal gradiente de velocidad de flujo causa un esfuerzo cortante que es paralelo a la superficie límite. Cuando una molécula se coloca en este flujo de corte, la molécula se reorienta para que su eje largo se alinee con la dirección del flujo, ya que la fuerza de cizallamiento se aplica al eje largo11. Como resultado de esta reorientación, se espera que todas las moléculas del mismo tipo (tamaño y longitud de los mangos) se alineen en la misma dirección mientras experimentan la misma fuerza de corte.
Este trabajo describe un protocolo para usar dicho flujo de cizallamiento para ejercer fuerza de cizallamiento sobre un conjunto masivo de estructuras moleculares, como lo ejemplifica el motivo i del ADN. En este protocolo, se genera un flujo de corte entre el rotor y el estator en una punta homogeneizadora. El presente estudio encontró que la estructura plegada del i-motivo del ADN podría desplegarse mediante velocidades de cizallamiento de 9724-97245 s−1. Además, se encontró una constante de disociación de 36 μM entre el ligando L2H2-4OTD y el motivo i. Este valor es consistente con el de 31 μM medido por el ensayo de desplazamiento de gel12. Además, la técnica actual se utiliza para desplegar el i-motivo, que puede exponer el cobre quelado (I) para catalizar una reacción de clic. Por lo tanto, este protocolo permite desplegar un gran conjunto de estructuras i-motif con instrumentos de bajo costo en un tiempo razonable (menos de 30 min). Dado que la técnica de fuerza de cizallamiento aumenta drásticamente el rendimiento de la espectroscopia de fuerza, llamamos a esta técnica espectroscopía de fuerza de conjunto (EFS). Este protocolo tiene como objetivo proporcionar directrices experimentales para facilitar la aplicación de este EFS basado en la fuerza de corte.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito en este manuscrito permite la investigación en tiempo real del despliegue de un conjunto de estructuras biomoleculares por fuerza de corte. Los resultados presentados aquí subrayan que las estructuras del motivo i del ADN pueden desplegarse mediante fuerza de corte. El despliegue del i-motivo ligado al ligando y las reacciones de clic accionadas por fuerza de cizallamiento fueron aplicaciones de prueba de concepto para este método de espectroscopia de fuerza de conjunto.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo de investigación fue apoyado por la National Science Foundation [CBET-1904921] y los Institutos Nacionales de Salud [NIH R01CA236350] a H. M.
Materials
| 3K MWCO Amicon | Millipore Sigma | ufc900324 | |
| Ascorbic acid | VWR | VWRC0143-100G | |
| Calfluor 488 azide | Click Chemistry Tools | 1369-1 | |
| CuCl | Thermo | ACRO270525000 | |
| Dispersion tip | Switzerland | PT-DA07/2EC-B101 | |
| DNA oligos | IDT | ||
| Dye | IDT | /5Cy5/ | |
| Fluorescence microscope | Janpan | Nikon TE2000-U | |
| Homogenizer | Switzerland | PT 3100D | |
| HPG | Santa Cruz Biotechnology | cs-295271 | |
| KCl | VWR | VWRC26760.295 | |
| MES | VWR | VWRCE169-500G | |
| Quencher | IDT | /3IAbRQSp/ | |
| TBTA | Tokyo Chemical Industry | T2993 | |
| Tris | VWR | VWRCE133-100G |
References
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