Kesme Kuvvetleri ile Topluluk Kuvveti Spektroskopisi
Summary
Topluluk kuvvet spektroskopisi (EFS), biyofiziksel ve biyosensing alanlarında bir grup biyomoleküler yapının mekanik olarak açılması ve gerçek zamanlı olarak algılanması için sağlam bir tekniktir.
Abstract
Floresan ve mekanokimyasal prensiplere dayanan tek moleküllü teknikler biyolojik algılamada üstün duyarlılık sağlar. Bununla birlikte, yüksek verim yeteneklerinin eksikliği nedeniyle, bu tekniklerin uygulanması biyofizikte sınırlıdır. Topluluk kuvvet spektroskopisi (EFS), bireysel moleküllerin mekanokimyasal çalışmalarını moleküler toplulukların çalışmalarına dönüştürerek büyük bir moleküler yapı kümesinin araştırılmasında yüksek verim göstermiştir. Bu protokolde, DNA ikincil yapıları (i-motifler), bir homojenizatör ucunun rotoru ile statoru arasındaki kesme akışında 77796 / s’ye kadar kesme hızlarında açılmıştır. Akış hızlarının ve moleküler boyutların i-motifin yaşadığı kesme kuvvetleri üzerindeki etkileri gösterilmiştir. EFS tekniği ayrıca DNA i-motifleri ve ligandlar arasındaki bağlanma afinitesini de ortaya çıkardı. Ayrıca, kesme kuvveti (yani, mekano-tıklama kimyası) ile harekete geçirilebilen bir tıklama kimyası reaksiyonu gösterdik. Bu sonuçlar, moleküler yapıların konformasyonunu kontrol etmek için kesme kuvveti kullanmanın etkinliğini ortaya koymaktadır.
Introduction
Tek moleküllü kuvvet spektroskopisi1’de (SMFS), bireysel moleküler yapıların mekanik özellikleri, atomik kuvvet mikroskobu, optik cımbız ve manyetik cımbız 2,3,4 gibi sofistike aletlerle incelenmiştir. Kuvvet üreten/algılayan kurulumlardaki moleküllerin aynı yönlülük gereksinimi veya manyetik cımbızdaki küçük görüş alanı ve minyatür santrifüj kuvvet mikroskobu (MCF)5,6,7,8 ile sınırlı olarak, SMFS kullanılarak aynı anda yalnızca sınırlı sayıda molekül araştırılabilir. SMFS’nin düşük verimi, büyük bir molekül kümesinin katılımını gerektiren moleküler tanıma alanındaki geniş uygulamasını önler.
Kesme akışı, büyük bir molekül kümesine kuvvet uygulamak için potansiyel bir çözüm sağlar9. Bir kanalın içindeki sıvı akışında, kanal yüzeyine ne kadar yakın olursa, akış hızı10 o kadar yavaş olur. Böyle bir akış hızı gradyanı, sınır yüzeyine paralel kesme gerilimine neden olur. Bir molekül bu kesme akışına yerleştirildiğinde, molekül kendisini yeniden yönlendirir, böylece kesme kuvveti uzun eksen11’e uygulandığında, uzun ekseni akış yönüyle hizalanır. Bu yeniden yönlendirmenin bir sonucu olarak, aynı tipteki tüm moleküllerin (sapların boyutu ve uzunluğu) aynı kesme kuvvetini yaşarken aynı yönde hizalanması beklenir.
Bu çalışma, DNA i-motifi tarafından örneklendiği gibi, büyük bir moleküler yapı kümesine kesme kuvveti uygulamak için böyle bir kesme akışını kullanmak için bir protokolü tanımlamaktadır. Bu protokolde, homojenizatör ucundaki rotor ve stator arasında bir kesme akışı oluşturulur. Bu çalışma, katlanmış DNA i-motif yapısının 9724-97245 s-1 kesme oranlarıyla açılabileceğini buldu. Ayrıca, L2H2-4OTD ligand ile i-motif arasında 36 μM’lik bir ayrışma sabiti bulundu. Bu değer, jel kayma testi 12 ile ölçülen 31 μM iletutarlıdır. Ayrıca, mevcut teknik, bir tıklama reaksiyonunu katalize etmek için şelatlı bakırı (I) açığa çıkarabilen i-motifi açmak için kullanılır. Bu protokol böylece, makul bir sürede (30 dakikadan daha kısa) düşük maliyetli aletlerle büyük bir dizi i-motif yapısının ortaya çıkmasına izin verir. Kesme kuvveti tekniğinin kuvvet spektroskopisinin verimini büyük ölçüde arttırdığı göz önüne alındığında, bu tekniğe topluluk kuvvet spektroskopisi (EFS) diyoruz. Bu protokol, bu kesme kuvvetine dayalı EFS’nin uygulanmasını kolaylaştırmak için deneysel kılavuzlar sağlamayı amaçlamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede açıklanan protokol, bir grup biyomoleküler yapının kesme kuvveti ile açılmasının gerçek zamanlı olarak araştırılmasına izin verir. Burada sunulan sonuçlar, DNA i-motif yapılarının kesme kuvveti ile açılabileceğinin altını çizmektedir. Ligand’a bağlı i-motifin açılması ve kesme kuvveti ile harekete geçirilmiş tıklama reaksiyonları, bu topluluk kuvveti spektroskopisi yöntemi için kavram kanıtı uygulamalarıydı.
Şekil 1’de</…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma çalışması, Ulusal Bilim Vakfı [CBET-1904921] ve Ulusal Sağlık Enstitüleri [NIH R01CA236350] tarafından H. M. tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 3K MWCO Amicon | Millipore Sigma | ufc900324 | |
| Ascorbic acid | VWR | VWRC0143-100G | |
| Calfluor 488 azide | Click Chemistry Tools | 1369-1 | |
| CuCl | Thermo | ACRO270525000 | |
| Dispersion tip | Switzerland | PT-DA07/2EC-B101 | |
| DNA oligos | IDT | ||
| Dye | IDT | /5Cy5/ | |
| Fluorescence microscope | Janpan | Nikon TE2000-U | |
| Homogenizer | Switzerland | PT 3100D | |
| HPG | Santa Cruz Biotechnology | cs-295271 | |
| KCl | VWR | VWRC26760.295 | |
| MES | VWR | VWRCE169-500G | |
| Quencher | IDT | /3IAbRQSp/ | |
| TBTA | Tokyo Chemical Industry | T2993 | |
| Tris | VWR | VWRCE133-100G |
References
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Woodside, M. T., et al. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6190-6195 (2006).
- Grandbois, M., Beyer, M., Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. How strong is a covalent bond. Science. 283 (5408), 1727-1730 (1999).
- Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V. Behavior of supercoiled DNA. Biophysical Journal. 74 (4), 2016-2028 (1998).
- Yang, D., Ward, A., Halvorsen, K., Wong, W. P. Multiplexed single-molecule force spectroscopy using a centrifuge. Nature Communications. 7, 11026 (2016).
- Su, H., et al. Light-responsive polymer particles as force clamps for the mechanical unfolding of target molecules. Nano Letters. 18 (4), 2630-2636 (2018).
- Kirkness, M. W. H., Forde, N. R. Single-molecule assay for proteolytic susceptibility: Force-induced collagen destabilization. Biophysical Journal. 114 (3), 570-576 (2018).
- Astumian, R. D. Thermodynamics and kinetics of molecular motors. Biophysical Journal. 98 (11), 2401-2409 (2010).
- Bekard, I. B., Asimakis, P., Bertolini, J., Dunstan, D. E. The effects of shear flow on protein structure and function. Biopolymers. 95 (11), 733-745 (2011).
- Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).
- Hu, C., Jonchhe, S., Pokhrel, P., Karna, D., Mao, H. Mechanical unfolding of ensemble biomolecular structures by shear force. Chemical Science. 12 (30), 10159-10164 (2021).
- Sedghi Masoud, S., et al. Analysis of interactions between telomeric i-motif DNA and a cyclic tetraoxazole compound. ChemBioChem. 19 (21), 2268-2272 (2018).
- Abraham Punnoose, J., et al. Adaptive and specific recognition of telomeric G-quadruplexes via polyvalency induced unstacking of binding units. Journal of the American Chemical Society. 139 (22), 7476-7484 (2017).
- Dhakal, S., et al. Coexistence of an ILPR i-motif and a partially folded structure with comparable mechanical stability revealed at the single-molecule level. Journal of the American Chemical Society. 132 (26), 8991-8997 (2010).
- Hu, C., Tahir, R., Mao, H. Single-molecule mechanochemical sensing. Accounts of Chemical Research. 55 (9), 1214-1225 (2022).
