Bloedplaatjesrijk plasmalysaat voor de behandeling van oogoppervlakziekten

Summary

Bloedplaatjeslysaten vormen een opkomend hulpmiddel voor de behandeling van oculaire oppervlakteziekten. Hier stellen we een methode voor voor de bereiding, dispensatie, opslag en karakterisering van bloedplaatjeslysaat verzameld van bloedplaatjesdonoren.

Abstract

Verschillende oculaire oppervlakteziekten worden behandeld met van bloed afgeleide oogdruppels. Het gebruik ervan is in de klinische praktijk geïntroduceerd vanwege hun metaboliet- en groeifactorgehalte, dat de regeneratie van het oogoppervlak bevordert. Op bloed gebaseerde oogdruppels kunnen worden bereid uit verschillende bronnen (d.w.z. volbloed- of bloedplaatjesferesedonatie), evenals met verschillende protocollen (bijv. Verschillende verdunningen en vries- / dooicycli). Deze variabiliteit belemmert de standaardisatie van klinische protocollen en bijgevolg de evaluatie van hun klinische werkzaamheid. Het detailleren en delen van de methodologische procedures kan bijdragen tot het vaststellen van gemeenschappelijke richtsnoeren. In de afgelopen jaren zijn allogene producten verspreid als een alternatief voor de autologe behandelingen, omdat ze hogere werkzaamheidsnormen garanderen; onder hen worden de bloedplaatjesrijke plasmalysaat (PRP-L) oogdruppels bereid met eenvoudige productieprocedures. In de afdeling transfusiegeneeskunde van AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Italië, wordt PRP-L verkregen uit bloedplaatjes-aferesedonatie. Dit product wordt in eerste instantie verdund tot 0,3 x 10⁹ bloedplaatjes/ml (uitgaande van een gemiddelde concentratie van 1 x 10⁹ bloedplaatjes/ml) in 0,9% NaCl. Verdunde bloedplaatjes worden ingevroren/ontdooid en vervolgens gecentrifugeerd om vuil te verwijderen. Het uiteindelijke volume wordt gesplitst in aliquots van 1,45 ml en bewaard bij −80 °C. Voordat ze aan patiënten worden verstrekt, worden oogdruppels getest op steriliteit. Patiënten kunnen bloedplaatjeslysaten opslaan bij −15 °C gedurende maximaal 1 maand. De samenstelling van de groeifactor wordt ook beoordeeld op basis van willekeurig geselecteerde aliquots en de gemiddelde waarden worden hier gerapporteerd.

Introduction

Bloedderivaten worden veel gebruikt in wondverzorging¹, maxillofaciale en orthopedische chirurgie, en voor de behandeling van verschillende oculaire oppervlakteziekten² zoals droge ogen (DED)³. Bij DED is de homeostase van de traanfilm aangetast als gevolg van het abnormaal functioneren van verschillende factoren die betrokken zijn bij de traanproductie en de integriteit van het oculaire oppervlak ^4,5.

DED wordt gekenmerkt door heterogeniteit in oorzaken en ernst ^6,7,8 en kan een gevolg zijn van verschillende factoren zoals veroudering, geslacht⁹, contactlenzen, actuele of systemische medicijnen¹⁰, of reeds bestaande aandoeningen zoals het syndroom van Sjögren¹⁰. Ondanks het hebben van milde symptomen, treft DED miljoenen mensen over de hele wereld, wat ook van invloed is op hun kwaliteit van leven en het gezondheidssysteem⁶.

Veel behandelingen zijn gemeld voor deze pathologie, maar er is nog steeds geen consensus over de meest effectieve oplossing¹². Tot op heden zijn kunstmatige tranen de eerste therapielijn gericht op het herstellen van de waterige samenstelling van de traanfilm, hoewel deze substituten niet de belangrijkste biologisch actieve opgeloste stoffen van natuurlijke tranen bevatten ^6,11. Op bloedplaatjes gebaseerde producten worden beschouwd als een geldig alternatief^12,13 voor kunstmatige tranen, hoewel hun klinische werkzaamheid, aanbevelingen voor gebruik en methoden van preparaten nog steeds een punt van discussie zijn³.

Bloedproducten delen met tranen een vergelijkbare samenstelling in termen van metabolieten¹⁴, eiwitten, lipiden, vitamines, ionen, groeifactoren (GFs), antioxidanten¹¹ en osmolariteit (300 mOsm / L)¹¹. Door de synergetische activiteit van hun componenten bevorderen ze de regeneratie van het cornea-epitheel, remmen ze de afgifte van inflammatoire cytokines en verhogen ze het aantal bokaalcellen en de expressie van mucines in het bindvlies ^2,3.

Tot nu toe is heterogeniteit in oogheelkundige bloedproducten gedocumenteerd in de literatuur; deze producten kunnen worden ingedeeld op basis van de oorsprong van de bloeddonoren, d.w.z. autoloog of allogeen, evenals de bloedbron, d.w.z. perifeer bloed, navelstrengbloed, serum of bloedplaatjes.

Hoewel autologe producten de meest voorkomende^{waren 3}, worden allogene producten nu de voorkeur, omdat ze zorgen voor hogere werkzaamheids- en veiligheidsnormen¹⁵, samen met een aanzienlijke kostenbesparing^16,17. Eerdere studies hebben inderdaad aangetoond dat bloedproducten verkregen van patiënten met auto-immuun- en/of systemische ziekten een veranderde kwaliteit en functionaliteit kunnen vertonen ^6,16,17. Ondanks het feit dat oogdruppels op basis van serum het meest wijdverspreid zijn, worden producten op basis van bloedplaatjes onlangs bevestigd als een geldig alternatief, omdat ze gemakkelijk kunnen worden bereid met behoud van aanzienlijke niveaus van werkzaamheid ^3,11. Momenteel beschikbare producten op basis van bloedplaatjes kunnen worden onderverdeeld in bloedplaatjesrijk plasma (PRP), bloedplaatjesrijk plasmalysaat (PRP-L) en plasma rijk aan groeifactoren (PRGF)³.

Onder hen heeft PRP-L het voordeel dat het een bevroren product met een lange levensduur is. PRP-L kan worden bereid uit aferese, buffy-coats of zelfs uit aflopende bloedplaatjes (PLTs)^18,19, waardoor hun verspilling kostbaar wordt verminderd. De aliquots kunnen maandenlang worden bewaard in de bloedtransfusiecentra bij −80 °C of zelfs bij patiënten thuis bij −15 °C voor kortere periodes.

PRP-L zijn sterk verrijkt in GF’s, waarvan is bewezen dat ze de regeneratie van het oogoppervlak stimuleren 12,20,21. Niettemin zijn er slechts weinig gerapporteerde klinische studies op dit gebied, en ze gebruikten allemaal autologe bronnen ^3,22. PRP-L heeft nog verdere validatie en karakterisering nodig voordat het routinematig kan worden gebruikt voor de behandeling van oogoppervlakziekten, omdat er geen gestandaardiseerde richtlijnen zijn voor de bereiding, dispensatie en opslag³.

Hierin wordt een gedetailleerd protocol gedeeld voor de productie van PRP-L gebruikt op de Transfusion Medicine Unit in AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Italië, en dispensatie aan patiënten met DED. We willen de wetenschappelijke gemeenschap helpen om standaard bereidingsmethoden te ontwikkelen, die de homogeniteit en consistentie in wereldwijde studies en klinische benaderingen kunnen vergroten.

Protocol

PRP-L gebruikt voor de kwantitatieve beoordeling van groeifactoren werd verzameld in een bredere studie over de karakterisering van PRP-producten voor regeneratieve doeleinden, uitgevoerd bij de AUSL-IRCCS di Reggio Emilia en goedgekeurd door de Area Vasta Emilia Nord Ethische Commissie op 10 januari 2019 (protocolnummer 2019/0003319). Donoren gaven hun geïnformeerde toestemming volgens de Verklaring van Helsinki. Er was geen ethische goedkeuring nodig voor het verzamelen van de geaggregeerde, anonieme gegevens van de O…

Representative Results

De reden voor het gebruik van serum-afgeleide oogdruppels (het op bloed gebaseerde product dat het vaakst wordt gebruikt voor de behandeling van oogoppervlakziekten) ligt in hun gehalte aan GFs, die bijna volledig zijn afgeleid van circulerende bloedplaatjes. PRP bevat een significant hoger aantal bloedplaatjes (en bijgevolg van van bloedplaatjes afgeleide GFs) in vergelijking met perifeer bloedserum, variërend tussen 0,15 x 10 9-0,45 x 109 PLTs / ml. Volgens de Italiaanse wetgeving moet het aantal…

Discussion

In de afgelopen jaren is het klinische gebruik van op bloedplaatjes gebaseerde producten voor oculaire oppervlaktepathologieën toegenomen, maar hun diffusie wordt belemmerd door het gebrek aan wetenschappelijke robuustheid. Dit wordt voornamelijk veroorzaakt door een grote heterogeniteit in donorbronnen en voorbereidingsprotocollen, die vaak niet volledig worden bekendgemaakt of niet specifiek zijn ontworpen voor het doel waarvoor ze worden verstrekt. Met name informatie over op bloedplaatjes gebaseerde producten die do…

Materials

Equipments
CompoSeal Mobilea II	Fresenius Kabi, Germany		bag sealer
HeraSafe hood	Heraeus Instruments, Germany		Class II biohazard hood
MCS+ 9000 Mobile Platelet Collection System	Haemonetics, Italy		automated plasma and multicomponent collection equipment for donating platelet, red cell, plasma, or combination blood components
Platelet shaker, PF396i	Helmer, USA		Platelet shaker
Raycell X-ray Blood Irradiator	MDS Nordion, Canada		X-ray Blood Irradiator
ROTIXA 50RS	Hettich Zentrifugen, Germany		High speed entrifuge
Sysmex XS-1000i	Sysmex Europe GMBH, Germany		haemocytometer for platelet count
Warm bath, WB-M15	Falc Instruments, Italy		Warm bath
Materials
ACD-A anticoagulant solution A	Fenwal Inc., USA	DIN 00788139	anticoagulant solution for platelet apheresis (1000 ml)
BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials	BD Biosciences, USA	BD 442020	Sterility assay
BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials	BD Biosciences, USA	442020	At least 2 vials for sterility assay
BD Luer Lok Syringe	BD Plastipack, USA	300865	At least 4 sterile syringes (50 ml)
Bio-Plex Human Cancer Panel 1	BioRad Laboratories, USA	171AC500M	Standard panel for PDGF isoforms assessment
Bio-Plex Human Cancer Panel 2	BioRad Laboratories, USA	171AC600M	Standard panel for EGF assessment
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader	BioRad Laboratories, USA	Magpix	This instrument allows multiple immunoassays using functionalized magnetic beads.
Bio-Plex Pro TGF-b Assay	BioRad Laboratories, USA	10024984	Set and standards for TGFb isoforms assessment
BioRet	ARIES s.r.l., Italy	A2DH0020	At least 4 piercing spike for blood bags
Blood collection tube	BD Vacutainer, USA	367835	1 tube, necessary to perform platelet counts
Eye drops kit. COL Medical Device for the application and preservation of eye drops from haemocomponents	Biomed Device s.r.l., Italy	COLC50	Eye drops kit. At least 2 kits for each PRP unit collected
Human Cancer PDGF-AB/BB Set 1x96well	BioRad Laboratories, USA	171BC511	Set for PDGF isoforms assessment
Human Cancer2 EGF Set 1x96well	BioRad Laboratories, USA	171BC603M	Set for EGF assessment
NaCl 0.9% sterile solution	Baxter S.p.A., Italy	B05BB01	1000 ml
OSDI Questionnaire	Allergan Inc., USA	OSDI	Ocular Surface Disease Index Questionnaire
Piercing spike	BioRet ARIES s.r.l., Italy	BS051004	Spike
Platelet Additive Solution A+ T-PAS+	TERUMO BCT Inc., Italy	40842	preservative solution for platelet concentrates (1000 ml)
Software Excel	Microsoft, USA	Excel	Data analysis software
Teruflex Transfer bag 1000 ml	TERUMO BCT Inc., Italy	BB*T100BM	1 for PRP dilution
Teruflex Transfer bag 300 ml	TERUMO BCT Inc., Italy	BB*030CM	At least 6 for each PRP unit collected