Summary

직장 오가노이드 형태 분석(ROMA): 낭포성 섬유증의 진단 분석

Published: June 10, 2022
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Summary

이 프로토콜은 낭포성 섬유증(CF)에 대한 새로운 진단 분석인 직장 오가노이드 형태 분석(ROMA)을 설명합니다. 형태 학적 특성, 즉 진원도 (원형도 지수, CI)와 루멘의 존재 (강도 비율, IR)는 CFTR 기능의 척도입니다. 189 명의 피험자를 분석 한 결과 CF와 비 CF가 완벽하게 구별되었습니다.

Abstract

낭포성 섬유증(CF)의 진단은 항상 간단한 것은 아니며, 특히 땀 염화물 농도가 중간이거나 질병을 유발하는 CFTR 돌연변이가 2개 미만인 경우 더욱 그렇습니다. 생리학적 CFTR 분석(비강 전위차, 장 전류 측정)이 진단 알고리즘에 포함되었지만 항상 쉽게 이용 가능하거나 실현 가능한 것은 아닙니다(예: 유아에서). 직장 오가노이드는 특정 조건에서 배양할 때 직장 생검의 음와에서 분리된 줄기 세포에서 자라는 3D 구조입니다. 비 CF 피험자의 유기체는 CFTR 매개 염화물 수송이 물을 내강으로 유도하기 때문에 둥근 모양과 유체로 채워진 내강을 가지고 있습니다. CFTR 기능에 결함이있는 유기체는 팽창하지 않고 불규칙한 모양을 유지하고 눈에 보이는 루멘이 없습니다. CF와 비 CF 오가노이드 간의 형태 차이는 새로운 CFTR 생리학적 분석으로 ‘직장 오가노이드 형태 분석'(ROMA)에서 정량화됩니다. ROMA 분석을 위해 오가노이드를 96웰 플레이트에 플레이팅하고 칼세인으로 염색한 다음 컨포칼 현미경으로 이미지화합니다. 형태 학적 차이는 두 가지 지수를 사용하여 정량화됩니다 : 원형도 지수 (CI)는 유기체의 진원도를 정량화하고 강도비 (IR)는 중심 루멘의 존재를 측정 한 것입니다. 비 CF 오가노이드는 CF 오가노이드에 비해 높은 CI와 낮은 IR을 갖는다. ROMA 지수는 CF가 없는 22명의 피험자와 CF가 있는 167명의 피험자를 완벽하게 구별하여 ROMA를 CF 진단에 도움이 되는 매력적인 생리학적 CFTR 분석법으로 만들었습니다. 직장 생검은 대부분의 병원에서 모든 연령대에서 일상적으로 수행 할 수 있으며 조직은 오가노이드 배양 및 ROMA를 위해 중앙 실험실로 보낼 수 있습니다. 미래에는 ROMA를 적용하여 체외에서 CFTR 조절제의 효능을 테스트할 수도 있습니다. 본 보고서의 목적은 ROMA에 사용되는 방법을 완전히 설명하고 다른 실험실에서 복제를 허용하는 것입니다.

Introduction

낭포성 섬유증(CF)은 CF 막횡단 전도도 조절제(CFTR) 유전자의 돌연변이로 인해 발생하는 상염색체 열성 질환입니다. CFTR 단백질은 염화물 및 중탄산염 채널로 여러 상피1의 수화를 보장합니다. CF는 주로 호흡기 질환으로 나타나지만 위장관, 췌장, 간 및 생식 기관에도 영향을 미치는 고부담, 수명 단축, 다중 시스템 질환입니다2.

질병을 유발하는 CFTR 돌연변이는 CFTR의 양이나 기능을 감소시켜 점액 탈수를 유발합니다. CFTR 유전자의 2,000개 이상의 변이체가 기술되었으며3, 그 중 466개만이 완전히 특성화되었습니다4.

CF의 진단은 땀 염화물 농도 (SCC)가 60 mmol / L의 임계 값을 초과하거나 두 가지 질병 유발 CFTR 돌연변이 (CFTR2 데이터베이스에 따름)가 확인 될4,5 할 수 있습니다. 땀 검사의 약 4%-5%에서 발생하는 중간 상승(30-60mmol/L) SCC만 있는 피험자6와 다양하거나 알려지지 않은 임상적 결과의 CFTR 돌연변이가 있는 피험자의 경우 CF 호환 증상이 있거나 신생아선별 검사에서 양성인 경우에도 진단을 확인하거나 배제할 수 없습니다. 이러한 경우 2차 생리학적 CFTR 분석(비강 전위차(NPD) 및 장 전류 측정(ICM))이 진단 알고리즘에 포함되었습니다. 이러한 검사는 대부분의 센터에서 쉽게 이용할 수 없으며 모든 연령대, 특히 유아에서 가능합니다5.

직장 오가노이드는 직장 생검을 통해 얻은 장자루에서 Lgr5(+) 성체 장 줄기 세포에서 성장한 3D 구조입니다7. 오가노이드는 CF8에서 변조기 처리 테스트와 같은 생물 의학 연구에서 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 생존 가능한 생검은 흡입 또는 겸자 생검으로 얻을 수 있으며, 이는 최소한의 불편 함을 유발하고 유아에서도 안전하며 합병증 비율이 낮습니다9. 직장 생검에서 분리 된 음와에는 줄기 세포가 풍부하며 특정 배양 조건에서 이들은 직장 오가노이드로 자체 구성됩니다. 이 유기체의 형태는 상피 세포의 정점 막에 위치한 CFTR의 발현과 기능에 의해 결정됩니다. 기능성 CFTR은 염화물과 물이 오가노이드 내강으로 들어가도록 하여 비-CF 오가노이드의 팽창을 유도합니다. CF 유기체는 팽창하지 않으며 눈에 보이는 루멘이 없습니다10,11.

직장 오가노이드 형태 분석(ROMA)은 이러한 오가노이드 형태의 차이를 기반으로 CF와 비-CF 오가노이드를 구별할 수 있습니다. 비 CF 오가노이드는 더 둥글고 눈에 보이는 루멘을 갖는 반면, CF 오가노이드의 경우 그 반대입니다. 이 분석을 위해 환자 특이적 오가노이드를 96웰 플레이트의 32개 웰에 플레이팅합니다. 성장 1일 후, 오가노이드는 칼세인 그린으로 염색되고 컨포칼 현미경으로 이미지화됩니다. 비 CF 오가노이드는 내강에 유체가 포함되어 있고 칼세인이 세포만 염색하기 때문에 더 원형이고 덜 형광적인 중앙 부분을 보여줍니다. 이러한 형태의 차이는 두 개의 ROMA 지수를 사용하여 정량화됩니다 : 원형도 지수 (CI)는 유기체의 진원도를 정량화하는 반면, 강도비 (IR)는 중심 루멘의 유무를 측정 한 것입니다. 이 보고서에서는 기술의 복제를 허용하기 위해 이러한 차별적 지수를 얻는 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

Protocol

인체 조직과 관련된 모든 절차에 대해 윤리위원회 연구 UZ/KU Leuven(EC 연구)의 승인을 획득했습니다. 모든 연구는 부모, 대리인 및/또는 환자의 사전 동의 및/또는 동의를 받아 수행되었습니다. 알림: 직장 생검 및 오가노이드와 관련된 모든 절차는 생물학적 위험으로부터 연구원을 보호하고 배양 물의 오염 위험을 최소화하기 위해 층류로 수행되어야 합니다. 모든 실험실 절차?…

Representative Results

212명의 피험자로부터의 오가노이드가 일상적인 임상 방문 동안 수집되었습니다. 직장 생검 절차 중 또는 후에 부작용이 발생하지 않았습니다. 오가노이드는 유전자형 및 임상 정보와 같은 피험자 특성에 눈이 먼 한 연구원에 의해 이미지화되었습니다. 저화질 이미지로 인해 23 명의 피사체가 제외되었습니다. 성공 및 실패한 오가노이드 배양 및 이미지 획득의 예는 그림 2에…

Discussion

우리는 직장 오가노이드 형태 분석 (ROMA)을위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. ROMA, IR 및 CI로 계산된 두 지수는 CF가 있는 피험자와 CF가 없는 피험자의 오가노이드를 완벽한 정확도로 구별했습니다. 따라서, ROMA는 SCC 및 다른 현재 이용 가능한 시험13,14,15를 보완하는 새로운 생리학적 CFTR 분석으로서 기능할 수 있다.

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Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구에 참여한 환자와 부모에게 감사드립니다. 우리는 오가노이드를 사용한 모든 배양 작업에 대해 Abida Bibi에게 감사드립니다. 엘스 에어트게르츠, 카롤리엔 브루닐, 클레어 콜라드, 릴리안 콜리뇽, 모니크 델포세, 안야 델포르테, 나탈리 페야르츠, 세실 람브레몽, 루트 니우보르그, 나탈리 피터스, 앤 라만, 핌 산센, 힐데 스티븐스, 마리안 슐테, 엘스 반 란스비크, 크리스텔 반 데 브랜드, 그리트 반 덴 아인데, 마를린 반데커켄, 잉게 반 다이크, 오드리 바게너, 모니카 와스키에비츠, 버나드 벤데릭스에게 물류 지원에 감사드립니다. 우리는 또한 Mucovereniging / Association Muco, 특히 Stefan Joris와 Jan Vanleeuwe 박사의 지원과 자금 지원에 감사드립니다. Hedwige Boboli (CHR Citadelle, Liège, 벨기에), Linda Boulanger (벨기에 루벤 대학 병원), Georges Casimir (HUDERF, 브뤼셀, 벨기에), Benedicte De Meyere (벨기에 겐트 대학 병원), Elke de Wachter (벨기에 브뤼셀 대학 병원), Danny De Looze (벨기에 겐트 대학 병원), Isabelle Etienne (CHU Erasme, 브뤼셀, 벨기에), Laurence Hanssens (HUDERF, 브뤼셀), 크리스티안 크눕 (CHU 에라스메, 브뤼셀, 벨기에), 모니크 르케스네 (벨기에 앤트워프 대학 병원), 비키 노베 (앤트워프 세인트 빈센티우스 병원 GZA), 더크 슈테센 (GZA 세인트 빈센티우스 병원 앤트워프), 스테파니 반 비에르블리에 (벨기에 겐트 대학 병원), 에바 반 브라켈 (벨기에 겐트 대학 병원), 킴 반 후렌비크 (벨기에 앤트워프 대학 병원), 에프 반데르헬스트 (벨기에 브뤼셀 대학 병원), Stijn Verhulst (앤트워프 대학 병원, 벨기에), 스테파니 빈켄 (벨기에 브뤼셀 대학 병원).

Materials

1.5 mL microcentrifuge tubes Sorenson 17040
15 mL conical tubes VWR 525-0605
24 well plates Corning 3526
96 well plates Greiner 655101
Brightfield microscope Zeiss Axiovert 40C
Centrifuge Eppendorf 5702
CO2 incubator Binder CB160
Computer Hewlett-Packard Z240
Confocal microscope  Zeiss LSM 800
Laminar flow hood Thermo Fisher 51025413
Material for organoid culture as detailed in previous protocol10
Micropipettes (20, 200, and 1000 µL) Eppendorf 3123000039, 3123000055, 3123000063
Microsoft Excel Microsoft Microsoft Excel 2019 MSO 64-bit Spreadsheet software
NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software  Nikon v.5.02.00 Imaging software
Pipette tips (20, 200, and 1000 µL) Greiner 774288, 775353, 750288
Zeiss Zen Blue software  Zeiss v2.6 Imaging software

References

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Citer Cet Article
Cuyx, S., Ramalho, A. S., Corthout, N., Fieuws, S., Fürstová, E., Arnauts, K., Ferrante, M., Verfaillie, C., Munck, S., Boon, M., Proesmans, M., Dupont, L., De Boeck, K., Vermeulen, F. Rectal Organoid Morphology Analysis (ROMA): A Diagnostic Assay in Cystic Fibrosis. J. Vis. Exp. (184), e63818, doi:10.3791/63818 (2022).

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