直腸オルガノイド形態分析(ROMA):嚢胞性線維症の診断アッセイ
Summary
このプロトコルは、嚢胞性線維症(CF)の新しい診断アッセイである直腸オルガノイド形態分析(ROMA)について説明しています。形態学的特徴、すなわち真円度(円形度指数、CI)および内腔の存在(強度比、IR)は、CFTR機能の尺度である。189人の被験者の分析は、CFと非CFの間の完全な識別を示しました。
Abstract
嚢胞性線維症(CF)の診断は、特に汗の塩化物濃度が中程度である場合、および/または2つ未満の疾患の原因となる CFTR 変異を特定できる場合、必ずしも簡単ではありません。生理学的CFTRアッセイ(鼻電位差、腸電流測定)は診断アルゴリズムに含まれていますが、必ずしも容易に利用可能または実行可能であるとは限りません(例:乳児)。直腸オルガノイドは、特定の条件下で培養した場合に直腸生検の陰窩から分離された幹細胞から成長する3D構造です。非CF被験者からのオルガノイドは、CFTRを介した塩化物輸送が水を内腔に送り込むため、丸い形状と液体で満たされた内腔を有する。CFTR機能に欠陥のあるオルガノイドは膨潤せず、不規則な形状を保ち、目に見える内腔を持たない。CFオルガノイドと非CFオルガノイドの形態の違いは、新しいCFTR生理学的アッセイとして「直腸オルガノイド形態分析」(ROMA)で定量化されています。ROMAアッセイでは、オルガノイドを96ウェルプレートにプレーティングし、カルセインで染色し、共焦点顕微鏡でイメージングします。形態学的差異は、2つの指標を使用して定量化されます:円形度指数(CI)はオルガノイドの真円度を定量化し、強度比(IR)は中心内腔の存在の尺度です。非CFオルガノイドは、CFオルガノイドと比較してCIが高く、IRが低い。ROMAインデックスは、CFの167人の被験者とCFのない22人の被験者を完全に区別し、ROMAをCF診断に役立つ魅力的な生理学的CFTRアッセイにしました。直腸生検は、ほとんどの病院ですべての年齢層で日常的に行うことができ、組織はオルガノイド培養とROMAのために中央研究所に送ることができます。将来的には、ROMAはCFTRモジュレーターの有効性を in vitroで試験するためにも適用される可能性があります。本レポートの目的は、ROMAに使用される方法を完全に説明し、他のラボでの複製を可能にすることです。
Introduction
嚢胞性線維症(CF)は、CF膜貫通コンダクタンス制御因子(CFTR)遺伝子の変異によって引き起こされる常染色体劣性疾患です。CFTRタンパク質は塩化物および重炭酸塩チャネルであり、いくつかの上皮1の水和を確実にする。CFは、主に呼吸器疾患として現れるだけでなく、胃腸管、膵臓、肝臓、および生殖管にも影響を与える、高負荷で寿命を縮める多系統疾患です2。
病気の原因となるCFTR変異は、 CFTR の量または機能の低下につながり、粘液脱水を引き起こします。 CFTR 遺伝子には2,000を超える変異体が記載されており3、そのうち466のみが完全に特徴付けられています4。
CFの診断は、汗塩化物濃度(SCC)が60 mmol / Lのしきい値を超えている場合、または2つの疾患の原因となるCFTR変異(CFTR2データベースによる)が特定された場合に行うことができます4,5。汗検査の約4%〜5%で発生する中程度に上昇した(30〜60 mmol / L)SCCのみの被験者6、およびさまざまなまたは未知の臨床的結果のCFTR変異では、CF互換の症状または新生児スクリーニング検査が陽性であっても、診断を確認または除外することはできません。これらの場合、セカンドラインの生理学的CFTRアッセイ(鼻電位差(NPD)および腸電流測定(ICM))が診断アルゴリズムに含まれています。これらの検査は、ほとんどのセンターで容易に利用できるわけではなく、すべての年齢、特に乳児5で実施可能ではありません。
直腸オルガノイドは、直腸生検7によって得られた腸陰窩からのLgr5(+)成体腸幹細胞から増殖した3D構造です。オルガノイドは、CF8でのモジュレーター治療のテストなど、生物医学研究でますます使用されています。実行可能な生検は、吸引生検または鉗子生検のいずれかによって得ることができ、不快感を最小限に抑え、乳児でも安全で、合併症の発生率は低い9。直腸生検から単離された陰窩は幹細胞に富み、特定の培養条件下では、これらは直腸オルガノイドに自己組織化します。これらのオルガノイドの形態は、上皮細胞の頂端膜に位置するCFTRの発現および機能によって決定される。機能的なCFTRは、塩化物と水がオルガノイド内腔に入ることを可能にし、それによって非CFオルガノイドの膨潤を誘発します。CFオルガノイドは膨潤せず、目に見える内腔を持たない10,11。
直腸オルガノイド形態解析(ROMA)は、オルガノイド形態におけるこれらの違いに基づいて、CFオルガノイドと非CFオルガノイドを区別することを可能にする。非CFオルガノイドはより丸く、目に見える内腔を有するが、CFオルガノイドはその逆である。このアッセイでは、患者特異的オルガノイドを96ウェルプレートの32ウェルにプレーティングします。成長の1日後、オルガノイドをカルセイングリーンで染色し、共焦点顕微鏡で画像化します。非CFオルガノイドは、内腔に液体が含まれ、カルセインが細胞のみを染色するため、より円形で蛍光性の低い中央部を示します。これらの形態の違いは、2つのROMAインデックスを使用して定量化されます:円形度インデックス(CI)はオルガノイドの真円度を定量化し、強度比(IR)は中心内腔の有無の尺度です。本報告では、これらの識別指標を取得し、技術の複製を可能にするためのプロトコルについて詳細に説明する。
Protocol
Representative Results
Discussion
直腸オルガノイド形態解析(ROMA)のための詳細なプロトコルを提供します。ROMA、IR、およびCIで計算された2つの指標は、CFのある被験者とCFのない被験者のオルガノイドを完全な精度で区別しました。したがって、ROMAは、SCCおよび他の現在利用可能な試験を補完する新しい生理学的CFTRアッセイとして機能する可能性がある13、14、<sup class="xref"…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究に参加した患者と保護者に感謝します。オルガノイドを使ったすべての培養作業について、アビダビビに感謝します。エルス・アールトゲルツ、カロリアン・ブルニール、クレア・コラード、リリアン・コリニョン、モニーク・デルフォス、アニヤ・デルポルト、ナタリー・フェイヤールツ、セシル・ランブルモン、ルート・ニューボルグ、ナタリー・ピーターズ、アン・ラマン、ピム・サンセン、ヒルデ・スティーブンス、マリアンヌ・シュルテ、エルス・ヴァン・ランズビーク、クリステル・ヴァン・デ・ブランデ、グリート・ヴァン・デン・アインデ、マーリーン・ヴァンデルケルケン、インゲ・ヴァン・ダイク、オードリー・ワグネル、モニカ・ワスキエヴィッチ、バーナード・ウェンデリックスの後方支援に感謝します。また、Mucovereniging/Association Muco、特にStefan JorisとJan Vanleeuwe博士の支援と資金提供にも感謝します。ヘドウィゲ・ボボリ(CHRシタデル、リエージュ、ベルギー)、リンダ・ブーランジェ(ベルギー、ルーヴェン大学病院)、ジョルジュ・カシミール(HUDERF、ブリュッセル、ベルギー)、ベネディクト・デ・マイエール(ゲント大学病院、ベルギー)、エルケ・デ・ワクター(ベルギー、ブリュッセル大学病院)、ダニー・デ・ルーズ(ゲント大学病院、ベルギー)、イザベル・エティエンヌ(CHUエラスム、ブリュッセル、ベルギー)、ローレンス・ハンセンス(HUDERF、 ブリュッセル)、クリスティアーネ・クヌープ(CHUエラスム、ブリュッセル、ベルギー)、モニーク・ルケイン(アントワープ大学病院、ベルギー)、ヴィッキー・ノウェ(GZAセントビンセンティウス病院アントワープ)、ディルク・シュテッセン(GZAセントビンセンティウス病院アントワープ)、ステファニー・ヴァン・ビアヴリート(ゲント大学病院、ベルギー)、エヴァ・ヴァン・ブレーケル(ゲント大学病院、ベルギー)、キム・ファン・ホーレンベック(アントワープ大学病院、ベルギー)、イーフ・ヴァンダーヘルスト(ブリュッセル大学病院、ベルギー)、スティン・フェルフルスト(アントワープ大学病院、 ベルギー)、ステファニーヴィンケン(ベルギー、ブリュッセル大学病院)。
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sorenson | 17040 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-0605 | |
| 24 well plates | Corning | 3526 | |
| 96 well plates | Greiner | 655101 | |
| Brightfield microscope | Zeiss | Axiovert 40C | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| CO2 incubator | Binder | CB160 | |
| Computer | Hewlett-Packard | Z240 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Laminar flow hood | Thermo Fisher | 51025413 | |
| Material for organoid culture as detailed in previous protocol10 | |||
| Micropipettes (20, 200, and 1000 µL) | Eppendorf | 3123000039, 3123000055, 3123000063 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Microsoft Excel 2019 MSO 64-bit | Spreadsheet software |
| NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software | Nikon | v.5.02.00 | Imaging software |
| Pipette tips (20, 200, and 1000 µL) | Greiner | 774288, 775353, 750288 | |
| Zeiss Zen Blue software | Zeiss | v2.6 | Imaging software |
References
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