Rektal Organoid Morfoloji Analizi (ROMA): Kistik Fibroziste Tanısal Bir Tahlil
Summary
Bu protokol, kistik fibroz (KF) için yeni bir tanısal test olan rektal organoid morfoloji analizini (ROMA) tanımlamaktadır. Morfolojik özellikler, yani yuvarlaklık (dairesellik indeksi, CI) ve bir lümenin varlığı (yoğunluk oranı, IR), CFTR fonksiyonunun bir ölçüsüdür. 189 deneğin analizi, CF ve CF olmayan arasında mükemmel bir ayrım olduğunu göstermiştir.
Abstract
Kistik fibrozis (KF) tanısı her zaman kolay değildir, özellikle ter klorür konsantrasyonu orta ve / veya ikiden az hastalığa neden olan CFTR mutasyonları tanımlanabilir. Fizyolojik CFTR testleri (nazal potansiyel fark, bağırsak akımı ölçümü) tanı algoritmasına dahil edilmiştir, ancak her zaman hazır veya uygulanabilir değildir (örneğin, bebeklerde). Rektal organoidler, belirli koşullar altında kültürlendiğinde rektal biyopsi kriptlerinden izole edilen kök hücrelerden büyüyen 3D yapılardır. CF olmayan deneklerden gelen organoidler yuvarlak bir şekle ve sıvı dolu bir lümene sahiptir, çünkü CFTR aracılı klorür taşınması suyu lümene yönlendirir. Kusurlu CFTR fonksiyonuna sahip organoidler şişmez, düzensiz bir şekil alır ve görünür lümeni yoktur. KF ve KF olmayan organoidler arasındaki morfolojideki farklılıklar, yeni bir CFTR fizyolojik testi olarak ‘Rektal Organoid Morfoloji Analizi’nde (ROMA) ölçülmüştür. ROMA testi için, organoidler 96 delikli plakalar halinde kaplanır, kalsein ile boyanır ve konfokal mikroskopta görüntülenir. Morfolojik farklılıklar iki indeks kullanılarak ölçülür: Dairesellik indeksi (CI) organoidlerin yuvarlaklığını ölçer ve yoğunluk oranı (IR) merkezi bir lümenin varlığının bir ölçüsüdür. CF olmayan organoidler, CF organoidlerine kıyasla yüksek CI ve düşük IR’ye sahiptir. ROMA indeksleri, CF’siz 22 denekten KF’li 167 deneği mükemmel bir şekilde ayırt etti ve ROMA’yı KF tanısına yardımcı olmak için çekici bir fizyolojik CFTR testi haline getirdi. Rektal biyopsiler çoğu hastanede her yaşta rutin olarak yapılabilir ve doku organoid kültür ve ROMA için merkezi bir laboratuvara gönderilebilir. Gelecekte, ROMA in vitro CFTR modülatörlerinin etkinliğini test etmek için de uygulanabilir. Bu raporun amacı, ROMA için kullanılan yöntemleri tam olarak açıklamak ve diğer laboratuvarlarda replikasyona izin vermektir.
Introduction
Kistik fibroz (KF), KF transmembran iletkenlik regülatörü (KFTR) genindeki mutasyonların neden olduğu otozomal resesif geçişli bir hastalıktır. CFTR proteini, birkaç epitel1’in hidrasyonunu sağlayan bir klorür ve bikarbonat kanalıdır. KF, öncelikle solunum yolu hastalığı olarak kendini gösteren, aynı zamanda gastrointestinal sistemi, pankreası, karaciğeri ve üreme sistemini de etkileyen, yüksek yüklü, yaşamı kısaltan, çok sistemli bir hastalıktır2.
Hastalığa neden olan CFTR mutasyonları, CFTR’nin miktarında veya fonksiyonunda bir azalmaya yol açar ve bu da mukus dehidrasyonuna neden olur. CFTR genindeki 2.000’den fazla varyant3 olarak tanımlanmıştır, bunlardan sadece 466’sı 4iyice karakterize edilmiştir.
CF tanısı, ter klorür konsantrasyonu (SCC) 60 mmol / L eşiğinin üzerinde olduğunda veya hastalığa neden olan iki CFTR mutasyonu (CFTR2 veritabanına göre) 4,5 tanımlandığında yapılabilir. Ter testlerinin yaklaşık% 4-5’inde ortaya çıkan sadece orta derecede yüksek (30-60 mmol / L) SCC’si olan deneklerde6 ve değişen veya bilinmeyen klinik sonuçlara sahip CFTR mutasyonlarında, KF uyumlu semptomları veya pozitif bir yenidoğan tarama testi olsa bile, tanı doğrulanamaz veya dışlanamaz. Bu olgular için ikinci basamak fizyolojik KFTR testleri (nazal potansiyel fark (NPD) ve intestinal akım ölçümleri (ICM)) tanı algoritmasına dahil edilmiştir. Bu testler çoğu merkezde hazır değildir ve her yaşta, özellikle de bebeklerde5.
Rektal organoidler, rektal biyopsi ile elde edilen bağırsak kriptlerinden Lgr5(+) erişkin bağırsak kök hücrelerinden yetiştirilen 3D yapılardır7. Organoidler, CF8’de modülatör tedavisinin test edilmesi gibi biyomedikal araştırmalarda giderek daha fazla kullanılmaktadır. Uygulanabilir bir biyopsi, emme veya forseps biyopsisi ile elde edilebilir, bu prosedür sadece minimum rahatsızlığa neden olur ve bebeklerde bile güvenlidir, düşük komplikasyon oranları9. Rektal biyopsilerden izole edilen kriptler kök hücrelerle zenginleştirilir ve spesifik kültürleme koşulları altında, bunlar rektal organoidler halinde kendi kendini organize eder. Bu organoidlerin morfolojisi, epitel hücrelerinin apikal zarında bulunan CFTR’nin ekspresyonu ve işlevi ile belirlenir. Fonksiyonel CFTR, klorür ve suyun organoid lümene girmesine izin verir, böylece CF olmayan organoidlerin şişmesine neden olur. CF organoidleri şişmez ve görünür lümen 10,11’e sahip değildir.
Rektal organoid morfoloji analizi (ROMA), organoid morfolojisindeki bu farklılıklara dayanarak KF ve KF dışı organoidler arasında ayrım yapılmasına olanak sağlar. CF olmayan organoidler daha yuvarlaktır ve görünür bir lümene sahipken, bunun tersi CF organoidleri için geçerlidir. Bu analiz için, hastaya özgü organoidler, 96 kuyucuklu bir plakanın 32 kuyusuna kaplanır. 1 günlük büyümeden sonra, organoidler kalsein yeşili ile boyanır ve konfokal bir mikroskopta görüntülenir. CF olmayan organoidler daha dairesel bir şekil ve daha az floresan bir orta kısım gösterir, çünkü lümen sıvı içerir ve kalsein sadece hücreleri boyar. Morfolojideki bu farklılıklar iki ROMA indeksi kullanılarak ölçülür: dairesellik indeksi (CI) organoidlerin yuvarlaklığını ölçerken, yoğunluk oranı (IR) merkezi bir lümenin varlığının veya yokluğunun bir ölçüsüdür. Bu raporda, tekniğin çoğaltılmasına izin vermek için bu ayrımcı indeksleri elde etmek için protokolü ayrıntılı olarak açıklayacağız.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rektal organoid morfoloji analizi (ROMA) için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. ROMA, IR ve CI ile hesaplanan iki indeks, organoidleri CF’li deneklerden CF’siz olanlardan mükemmel doğrulukla ayırdı. ROMA böylece SCC’yi ve şu anda mevcut olan diğer testleri 13,14,15’i tamamlayan yeni bir fizyolojik CFTR testi olarak işlev görebilir.
Protokol, CFTR işlevsel olduğunda yuvarlak bir şekle v…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmaya katılan hasta ve velilere teşekkür ederiz. Abida Bibi’ye organoidlerle yaptığı tüm kültür çalışmaları için teşekkür ederiz. Els Aertgeerts, Karolien Bruneel, Claire Collard, Liliane Collignon, Monique Delfosse, Anja Delporte, Nathalie Feyaerts, Cécile Lambremont, Lut Nieuwborg, Nathalie Peeters, Ann Raman, Pim Sansen, Hilde Stevens, Marianne Schulte, Els Van Ransbeeck, Christel Van de Brande, Greet Van den Eynde, Marleen Vanderkerken, Inge Van Dijck, Audrey Wagener, Monika Waskiewicz ve Bernard Wenderickx’e lojistik destek için teşekkür ederiz. Ayrıca Mucovereniging/Association Muco’ya ve özellikle Stefan Joris ve Dr. Jan Vanleeuwe’ye destekleri ve finansmanları için teşekkür ederiz. Belçika Organoid Projesi’nden tüm işbirlikçilere teşekkür ederiz: Hedwige Boboli (CHR Citadelle, Liège, Belçika), Linda Boulanger (Üniversite Hastaneleri Leuven, Belçika), Georges Casimir (HUDERF, Brüksel, Belçika), Benedicte De Meyere (Üniversite Hastanesi Gent, Belçika), Elke De Wachter (Üniversite Hastanesi Brüksel, Belçika), Danny De Looze (Üniversite Hastanesi Gent, Belçika), Isabelle Etienne (CHU Erasme, Brüksel, Belçika), Laurence Hanssens (HUDERF, Brüksel), Christiane Knoop (CHU Erasme, Brüksel, Belçika), Monique Lequesne (Anvers Üniversite Hastanesi, Belçika), Vicky Nowé (GZA St. Vincentius Hastanesi Anvers), Dirk Staessen (GZA St. Vincentius Hastanesi Anvers), Stephanie Van Biervliet (Gent Üniversitesi Hastanesi, Belçika), Eva Van Braeckel (Üniversite Hastanesi Gent, Belçika), Kim Van Hoorenbeeck (Üniversite Hastanesi Anvers, Belçika), Eef Vanderhelst (Üniversite Hastanesi Brüksel, Belçika), Stijn Verhulst (Anvers Üniversite Hastanesi, Belçika), Stefanie Vincken (Brüksel Üniversite Hastanesi, Belçika).
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sorenson | 17040 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-0605 | |
| 24 well plates | Corning | 3526 | |
| 96 well plates | Greiner | 655101 | |
| Brightfield microscope | Zeiss | Axiovert 40C | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| CO2 incubator | Binder | CB160 | |
| Computer | Hewlett-Packard | Z240 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Laminar flow hood | Thermo Fisher | 51025413 | |
| Material for organoid culture as detailed in previous protocol10 | |||
| Micropipettes (20, 200, and 1000 µL) | Eppendorf | 3123000039, 3123000055, 3123000063 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Microsoft Excel 2019 MSO 64-bit | Spreadsheet software |
| NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software | Nikon | v.5.02.00 | Imaging software |
| Pipette tips (20, 200, and 1000 µL) | Greiner | 774288, 775353, 750288 | |
| Zeiss Zen Blue software | Zeiss | v2.6 | Imaging software |
References
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4922), 1066-1073 (1989).
- Castellani, C., et al. ECFS best practice guidelines: the 2018 revision. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (2), 153-178 (2018).
- . CFTR2 Available from: https://www.cftr2.org/ (2022)
- Farrell, P. M., et al. Diagnosis of cystic fibrosis: Consensus guidelines from the cystic fibrosis foundation. The Journal of Pediatrics. 181, 4-15 (2017).
- Vermeulen, F., Lebecque, P., De Boeck, K., Leal, T. Biological variability of the sweat chloride in diagnostic sweat tests: A retrospective analysis. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 16 (1), 30-35 (2017).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: An in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (120), e55159 (2017).
- Friedmacher, F., Puri, P. Rectal suction biopsy for the diagnosis of Hirschsprung’s disease: a systematic review of diagnostic accuracy and complications. Pediatric Surgery International. 31 (9), 821-830 (2015).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Dekkers, J. F., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Science Translational Medicine. 8 (344), (2016).
- Vonk, A. M., et al. Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids. STAR Protocols. 1 (1), 100019 (2020).
- Cuyx, S., et al. Rectal organoid morphology analysis (ROMA) as a promising diagnostic tool in cystic fibrosis. Thorax. 76 (11), 1146-1149 (2021).
- Wilschanski, M., et al. Mutations in the cystic fibrosis transmembrane regulator gene and in vivo transepithelial potentials. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174 (7), 787-794 (2006).
- Derichs, N., et al. Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data. Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).
- Ramalho, A. S., et al. Correction of CFTR function in intestinal organoids to guide treatment of Cystic Fibrosis. European Respiratory Journal. 57, 1902426 (2020).
