Dit protocol beschrijft rectale organoïde morfologie analyse (ROMA), een nieuwe diagnostische test voor cystic fibrosis (CF). Morfologische kenmerken, namelijk de rondheid (circulariteitsindex, CI) en de aanwezigheid van een lumen (intensiteitsverhouding, IR), zijn een maat voor de CFTR-functie. Analyse van 189 proefpersonen toonde perfecte discriminatie tussen CF en niet-CF.
De diagnose van cystische fibrose (CF) is niet altijd eenvoudig, vooral wanneer de zweetchlorideconcentratie gemiddeld is en/of minder dan twee ziekteveroorzakende CFTR-mutaties kunnen worden geïdentificeerd. Fysiologische CFTR-assays (nasale potentiaalverschil, intestinale stroommeting) zijn opgenomen in het diagnostische algoritme, maar zijn niet altijd direct beschikbaar of haalbaar (bijvoorbeeld bij zuigelingen). Rectale organoïden zijn 3D-structuren die groeien uit stamcellen geïsoleerd uit crypten van een rectale biopsie wanneer ze onder specifieke omstandigheden worden gekweekt. Organoïden van niet-CF-proefpersonen hebben een ronde vorm en een met vloeistof gevuld lumen, omdat CFTR-gemedieerd chloridetransport water in het lumen drijft. Organoïden met een defecte CFTR-functie zwellen niet op, behouden een onregelmatige vorm en hebben geen zichtbaar lumen. Verschillen in morfologie tussen CF- en niet-CF-organoïden worden gekwantificeerd in de ‘Rectal Organoid Morphology Analysis’ (ROMA) als een nieuwe CFTR fysiologische assay. Voor de ROMA-test worden organoïden verguld in platen met 96 putten, gekleurd met calceïne en afgebeeld in een confocale microscoop. Morfologische verschillen worden gekwantificeerd met behulp van twee indexen: de circulariteitsindex (CI) kwantificeert de rondheid van organoïden en de intensiteitsverhouding (IR) is een maat voor de aanwezigheid van een centraal lumen. Niet-CF-organoïden hebben een hoge CI en lage IR in vergelijking met CF-organoïden. ROMA-indexen onderscheidden perfect 167 proefpersonen met CF van 22 proefpersonen zonder CF, waardoor ROMA een aantrekkelijke fysiologische CFTR-test was om te helpen bij CF-diagnose. Rectale biopsieën kunnen routinematig worden uitgevoerd op alle leeftijden in de meeste ziekenhuizen en weefsel kan worden verzonden naar een centraal laboratorium voor organoïde cultuur en ROMA. In de toekomst kan ROMA ook worden toegepast om de werkzaamheid van CFTR-modulatoren in vitro te testen. Het doel van dit rapport is om de methoden die voor ROMA worden gebruikt volledig uit te leggen, om replicatie in andere laboratoria mogelijk te maken.
Cystic fibrosis (CF) is een autosomaal recessieve ziekte veroorzaakt door mutaties in het CF transmembraan geleidingsregulator (CFTR) gen. Het CFTR-eiwit is een chloride- en bicarbonaatkanaal, dat zorgt voor hydratatie van verschillende epithelia1. CF is een ziekte met een hoge belasting, die het leven verkort, multisysteem, die zich voornamelijk manifesteert als een luchtwegaandoening, maar ook het maagdarmkanaal, de alvleesklier, de lever en het voortplantingskanaalaantast 2.
Ziekteverwekkende CFTR-mutaties leiden tot een afname van de hoeveelheid of functie van CFTR, wat op zijn beurt slijmuitdroging veroorzaakt. Meer dan 2.000 varianten in het CFTR-gen zijn beschreven3, waarvan er slechts 466 grondig zijn gekarakteriseerd4.
Een diagnose van CF kan worden gesteld wanneer de zweetchlorideconcentratie (SCC) boven de drempel van 60 mmol/l ligt of wanneer twee ziekteverwekkende CFTR-mutaties (volgens de CFTR2-database) worden geïdentificeerd 4,5. Bij proefpersonen met slechts gemiddeld verhoogde (30-60 mmol/L) SCC, die voorkomt in ongeveer 4%-5% van de zweettests6, en CFTR-mutaties met variërende of onbekende klinische gevolgen, kan de diagnose niet worden bevestigd of uitgesloten, zelfs niet wanneer ze CF-compatibele symptomen of een positieve neonatale screeningstest hebben. Voor deze gevallen zijn tweedelijns fysiologische CFTR-assays (nasale potentiaalverschil (NPD) en intestinale stroommetingen (ICM)) opgenomen in het diagnostische algoritme. Deze tests zijn niet direct beschikbaar in de meeste centra en ook niet haalbaar op alle leeftijden, vooral bij baby’s5.
Rectale organoïden zijn 3D-structuren gekweekt uit Lgr5 (+) volwassen darmstamcellen uit darmcrypten verkregen door rectale biopsie7. Organoïden worden steeds vaker gebruikt in biomedisch onderzoek, zoals het testen van modulatorbehandeling in CF8. Een levensvatbare biopsie kan worden verkregen door zuig- of tangbiopsie, een procedure die slechts minimaal ongemak veroorzaakt en zelfs bij zuigelingen veilig is, met lage complicatiepercentages9. De crypten geïsoleerd uit de rectale biopsieën zijn verrijkt in stamcellen en onder specifieke kweekomstandigheden organiseren deze zichzelf in rectale organoïden. De morfologie van deze organoïden wordt bepaald door de expressie en functie van CFTR, gelegen aan het apicale membraan van epitheelcellen. Functionele CFTR zorgt ervoor dat chloride en water het organoïde lumen kunnen binnendringen, waardoor zwelling van niet-CF-organoïden wordt veroorzaakt. CF-organoïden zwellen niet op en hebben geen zichtbaar lumen10,11.
Rectale organoïde morfologie analyse (ROMA) maakt de discriminatie tussen CF en niet-CF organoïden mogelijk op basis van deze verschillen in organoïde morfologie. Niet-CF-organoïden zijn ronder en hebben een zichtbaar lumen, terwijl het tegenovergestelde geldt voor CF-organoïden. Voor deze test worden patiëntspecifieke organoïden geplateerd in 32 putten van een 96-well plaat. Na 1 dag groeien worden de organoïden gekleurd met calceïnegroen en afgebeeld in een confocale microscoop. De niet-CF-organoïden vertonen een meer cirkelvormige vorm en een minder fluorescerend centraal deel, omdat het lumen vloeistof bevat en calceïne alleen cellen bevlekt. Deze verschillen in morfologie worden gekwantificeerd met behulp van twee ROMA-indexen: de circulariteitsindex (CI) kwantificeert de rondheid van organoïden, terwijl de intensiteitsverhouding (IR) een maat is voor de aan- of afwezigheid van een centraal lumen. In dit rapport beschrijven we in detail het protocol om deze discriminerende indexen te verkrijgen, om replicatie van de techniek mogelijk te maken.
We bieden een gedetailleerd protocol voor rectale organoïde morfologie-analyse (ROMA). De twee indexen berekend met ROMA, IR en CI, onderscheidden organoïden van proefpersonen met CF van die zonder CF met perfecte nauwkeurigheid. ROMA zou dus kunnen functioneren als een nieuwe fysiologische CFTR-test die complementair is aan SCC en andere momenteel beschikbare tests 13,14,15.
Het protocol is afhanke…
The authors have nothing to disclose.
We bedanken de patiënten en ouders die hebben deelgenomen aan dit onderzoek. We bedanken Abida Bibi voor al het kweekwerk met de organoïden. We danken Els Aertgeerts, Karolien Bruneel, Claire Collard, Liliane Collignon, Monique Delfosse, Anja Delporte, Nathalie Feyaerts, Cécile Lambremont, Lut Nieuwborg, Nathalie Peeters, Ann Raman, Pim Sansen, Hilde Stevens, Marianne Schulte, Els Van Ransbeeck, Christel Van de Brande, Greet Van den Eynde, Marleen Vanderkerken, Inge Van Dijck, Audrey Wagener, Monika Waskiewicz en Bernard Wenderickx voor logistieke ondersteuning. We danken ook de Mucovereniging/Vereniging Muco, en in het bijzonder Stefan Joris en Dr. Jan Vanleeuwe, voor hun steun en financiering. We bedanken alle medewerkers van het Belgian Organoid Project: Hedwige Boboli (CHR Citadelle, Luik, België), Linda Boulanger (Universitaire Ziekenhuizen Leuven, België), Georges Casimir (HUDERF, Brussel, België), Benedicte De Meyere (Universitair Ziekenhuis Gent, België), Elke De Wachter (Universitair Ziekenhuis Brussel, België), Danny De Looze (Universitair Ziekenhuis Gent, België), Isabelle Etienne (CHU Erasme, Brussel, België), Laurence Hanssens (HUDERF, Brussel), Christiane Knoop (CHU Erasme, Brussel, België), Monique Lequesne (Universitair Ziekenhuis Antwerpen, België), Vicky Nowé (GZA St. Vincentius Ziekenhuis Antwerpen), Dirk Staessen (GZA St. Vincentius Ziekenhuis Antwerpen), Stephanie Van Biervliet (Universitair Ziekenhuis Gent, België), Eva Van Braeckel (Universitair Ziekenhuis Gent, België), Kim Van Hoorenbeeck (Universitair Ziekenhuis Antwerpen, België), Eef Vanderhelst (Universitair Ziekenhuis Brussel, België), Stijn Verhulst (Universitair Ziekenhuis Antwerpen, België), Stefanie Vincken (Universitair Ziekenhuis Brussel, België).
1.5 mL microcentrifuge tubes | Sorenson | 17040 | |
15 mL conical tubes | VWR | 525-0605 | |
24 well plates | Corning | 3526 | |
96 well plates | Greiner | 655101 | |
Brightfield microscope | Zeiss | Axiovert 40C | |
Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
CO2 incubator | Binder | CB160 | |
Computer | Hewlett-Packard | Z240 | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
Laminar flow hood | Thermo Fisher | 51025413 | |
Material for organoid culture as detailed in previous protocol10 | |||
Micropipettes (20, 200, and 1000 µL) | Eppendorf | 3123000039, 3123000055, 3123000063 | |
Microsoft Excel | Microsoft | Microsoft Excel 2019 MSO 64-bit | Spreadsheet software |
NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software | Nikon | v.5.02.00 | Imaging software |
Pipette tips (20, 200, and 1000 µL) | Greiner | 774288, 775353, 750288 | |
Zeiss Zen Blue software | Zeiss | v2.6 | Imaging software |