Preparazione del nervo sciatico di ratto per la neurofisiologia Ex Vivo

Summary

Questo protocollo descrive la preparazione del tessuto nervoso sciatico intero di ratto per la stimolazione elettrofisiologica ex vivo e la registrazione in un bagno salino perfuso a due compartimenti regolato dall’ambiente.

Abstract

I preparati ex vivo consentono lo studio di molti processi neurofisiologici in isolamento dal resto del corpo, preservando la struttura tissutale locale. Questo lavoro descrive la preparazione dei nervi sciatici di ratto per la neurofisiologia ex vivo , compresa la preparazione del tampone, le procedure animali, la configurazione delle apparecchiature e la registrazione neurofisiologica. Questo lavoro fornisce una panoramica dei diversi tipi di esperimenti possibili con questo metodo. Il metodo delineato mira a fornire 6 ore di stimolazione e registrazione sul tessuto nervoso periferico estratto in condizioni strettamente controllate per una coerenza ottimale nei risultati. I risultati ottenuti con questo metodo sono potenziali d’azione composti in fibra A (CAP) con ampiezze da picco a picco nell’intervallo millivolt per l’intera durata dell’esperimento. Le ampiezze e le forme del CAP sono coerenti e affidabili, rendendole utili per testare e confrontare nuovi elettrodi con modelli esistenti o gli effetti di interventi sul tessuto, come l’uso di sostanze chimiche, alterazioni chirurgiche o tecniche di stimolazione neuromodulatoria. Sono stati testati sia gli elettrodi per polsini convenzionali disponibili in commercio con contatti platino-iridio che gli elettrodi di elastomero conduttivo su misura e hanno dato risultati simili in termini di risposta forza-durata dello stimolo nervoso.

Introduction

L’attuale comprensione della funzione nervosa fondamentale come modellata in silico è carente in diversi aspetti, in particolare per quanto riguarda gli effetti della compartimentazione del tessuto nervoso al di fuori del soma, dell’assone e dei dendriti. Le interazioni assone-mielina sono ancora poco comprese, come evidenziato dal fatto che anche modelli nervosi computazionali dettagliati come MRG¹ (per i nervi dei mammiferi) che catturano adeguatamente la risposta di stimolazione elettrica convenzionale, non catturano altri comportamenti osservati sperimentalmente come il carryover di blocco ad alta frequenza² o la risposta di insorgenza secondaria³.

Questo protocollo fornisce un metodo per studiare in modo efficiente i processi neurofisiologici a livello nervoso in un modello acuto di piccoli animali da laboratorio, utilizzando un protocollo di preparazione standardizzato per isolare il nervo, controllarne l’ambiente e rimuoverlo da un contesto in vivo a un contesto ex vivo. Ciò impedirà altri processi corporei o anestetici utilizzati dai protocolli di stimolazione nervosa in vivo per alterare il comportamento nervoso e confondere i risultati misurati o la loro interpretazione ^4,5. Ciò consente lo sviluppo di modelli più realistici incentrati esclusivamente su effetti specifici dei tessuti nervosi che sono poco compresi. Questo protocollo è anche utile come banco di prova per la stimolazione nervosa e la registrazione di materiali e geometrie degli elettrodi, nonché nuovi paradigmi di stimolazione come il blocco ad alta frequenza ^2,3. Variazioni di questa tecnica sono state utilizzate in precedenza per studiare la fisiologia nervosa in condizioni strettamente controllate⁶, ad esempio, per misurare la dinamica e le proprietà dei canali ionici o gli effetti degli anestetici locali⁷.

Questa tecnica offre diversi vantaggi rispetto ad alternative come la sperimentazione acuta in vivo su piccoli animali⁸. La tecnica evita la necessità di mantenere la profondità dell’anestesia poiché il tessuto è stato estratto dal corpo, riducendo la quantità di attrezzature necessarie come un diffusore anestetico, un concentratore di ossigeno e una piastra riscaldante. Questo semplifica il protocollo sperimentale, riducendo il rischio di errori. Poiché gli anestetici possono potenzialmente alterare la funzione nervosa⁴, questa tecnica garantisce che le misure non siano confuse dagli effetti collaterali di questi composti anestetici. Infine, questa tecnica è più appropriata degli esperimenti acuti in vivo quando si studiano gli effetti di composti neurotossici come la tetrodotossina, che ucciderebbe un animale anestetizzato per paralisi.

Le sezioni nervose periferiche sono un sistema ex vivo unico poiché vi è un’alta probabilità che le fibre responsabili dei segnali neurali registrati non contengano alcun soma. Poiché questi sarebbero normalmente localizzati, per i motoneuroni, nella colonna vertebrale e per i neuroni sensoriali nei gangli della radice dorsale vicino alla colonna vertebrale, la preparazione di una sezione del nervo dei mammiferi può essere approssimativamente modellata come una raccolta di membrane tubolari con canali ionici, aperti ad entrambe le estremità⁹. Il metabolismo è mantenuto dai mitocondri situati nell’assone al momento della dissezione tissutale¹⁰. La sutura delle estremità aperte dell’axolemma è incoraggiata dopo l’estrazione per chiuderle e quindi aiutare a mantenere i gradienti ionici esistenti attraverso la membrana, che sono essenziali per la normale funzione nervosa.

Per mantenere l’omeostasi tissutale al di fuori del corpo, diverse variabili ambientali devono essere strettamente controllate. Questi sono temperatura¹¹, ossigenazione¹², osmolarità, pH^13,14 e accesso al glucosio per mantenere il metabolismo. Per questo protocollo, l’approccio consiste nell’utilizzare un tampone Krebs-Henseleit^{modificato 15,16} (mKHB) continuamente aerato con una miscela di ossigeno e anidride carbonica. L’mKHB fa parte della famiglia dei tamponi cardioplegici ^6,17 utilizzati per preservare i tessuti sezionati al di fuori del corpo, ad esempio in esperimenti ex vivo. Questi tamponi non contengono emoglobina, antibiotici o antifungini e sono, quindi, adatti solo per preparazioni che coinvolgono piccole quantità di tessuto per un tempo limitato. Il controllo del pH è stato ottenuto con la coppia redox carbonato e anidride carbonica, che richiede un’aerazione costante del tampone con anidride carbonica per mantenere l’equilibrio del pH. Questo per evitare l’uso di altri agenti tampone comuni come HEPES, che possono modificare la funzione delle cellule nervose¹⁸. Per ossigenare il tampone e fornire il controllo del pH, è stata utilizzata una miscela di anidride carbonica al 5% in ossigeno chiamata carbogeno (95_{% O} 2, 5% CO₂). Un agitatore di riscaldamento è stato utilizzato per il controllo della temperatura di un contenitore tampone e il tampone è stato perfuso attraverso un bagno nervoso e quindi rimesso in circolo nel contenitore di partenza. Un esperimento tipico durerebbe 6-8 ore prima che il nervo perda la sua vitalità e non risponda più sufficientemente alla stimolazione affinché le misure siano rappresentative del tessuto sano.

Per ottimizzare il rapporto segnale-rumore, per la registrazione sono stati utilizzati elettrodi di cloruro d’argento, che sono stati preparati secondo i metodi precedentemente descritti¹⁹. Per la stimolazione, è possibile utilizzare una combinazione di elettrodi commerciali per polsini in platino pronti all’uso e elettrodi per polsini in polimero conduttivo su misura. Gli elettrodi per polsini polimerici conduttivi hanno capacità di carica notevolmente più elevate, che sono utili quando si stimola il nervo utilizzando forme d’onda ad alta ampiezza²⁰.

Lo stimolatore utilizzato in questo protocollo è stato precedentemente descritto²⁰. Documentazione, file di progettazione e script software per utilizzarlo sono disponibili pubblicamente²¹. Altri stimolatori possono essere utilizzati per eseguire questo protocollo; tuttavia, lo stimolatore personalizzato è anche in grado di bloccare^{2,20 il blocco 2,20} di corrente alternativa ad alta frequenza (HFAC), che consente una gamma più ampia di esperimenti di neurofisiologia. Per utilizzare il blocco HFAC, si raccomandano polsini in elastomero conduttivo per evitare danni al nervo. I polsini nervosi in elastomero conduttivo sono array di elettrodi morbidi e completamente polimerici prodotti da elastomeri conduttivi come componente conduttivo e polidimetilsilossano come isolamento²². I dispositivi sono stati fabbricati in una configurazione bipolare utilizzando tecniche convenzionali di microfabbricazione laser.

Protocol

Tutte le procedure e la cura degli animali sono state eseguite con licenze appropriate rilasciate dal Ministero degli Interni del Regno Unito ai sensi dell’Animals (Scientific Procedures) Act (1986) e sono state approvate dall’Animal Welfare and Ethical Review Board dell’Imperial College di Londra. 1. Preparazione dei buffer NOTA: Questa parte del protocollo può essere eseguita con largo anticipo rispetto al resto del protocollo, ad eccezione delle f…

Representative Results

I risultati rappresentativi che possono essere ottenuti con questo protocollo sono i potenziali d’azione composti coerenti dalle fibre nervose di tipo A all’interno del nervo sciatico. Questi potenziali d’azione hanno tipicamente un’ampiezza da picco a picco di circa 1 mV all’elettrodo e quindi di 100 mV una volta amplificati (Figura 2). Ampiezze di stimolazione e larghezze di impulso simili dovrebbero produrre ampiezze CAP simili. Gli elettrodi per polsini in elastomero conduttivo richiedon…

Discussion

In questo lavoro, abbiamo descritto un protocollo per preparare i nervi sciatici di ratto per la neurofisiologia ex vivo. L’estrazione dei tessuti richiede circa 30 minuti, compresa la manipolazione degli animali, l’anestesia, l’abbattimento e la dissezione, mentre la pulizia dei nervi, il posizionamento nel bagno e l’impianto dell’elettrodo dovrebbero richiedere altri 30 minuti prima che la registrazione possa essere avviata. La preparazione del buffer può essere eseguita in 30 minuti, anche se questo può ess…

Materials

1 L Glass bottle	VWR International Ltd	215-1595	Borosilicate glass
1 L Glass graduated flask	VWR International Ltd	612-3626	Borosilicate glass
2 L Glass bottle	VWR International Ltd	215-1596	Borosilicate glass
2 L Glass graduated flask	VWR International Ltd	BRND937254	Borosilicate glass
Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT	RS UK	536-2599	push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube
Alkoxy conformal coating	Farnell	1971829	ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation
Anesthetic	Chanelle	N/A	Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle
Beaker, 2 L	VWR International Ltd	213-0469	Borosilicate glass
Bipolar nerve cuff	Cortec GMBH	N/A	800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination
Bossheads	N/A	N/A	Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods
Calcium Chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902-500g	500 g in plastic bottle
Carbogen canister	BOC	N/A	F-size canister
Centrifuge Tubes, 15 mL volume	VWR International Ltd	734-0451	Falcon tubes
Conductive elastomer nerve cuff	N/A	N/A	high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference
Connector, Termimate	Mouser UK	538-505073-1100-LP	These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11)
Crocodile clip connectors	RS UK	212-1203	These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10)
Deionized Water	N/A	N/A	Obtained from deionized water dispenser
Forceps angled 45 degrees	InterFocus Ltd	91110-10	Fine forceps, student range
Forceps standard Dumont #7	InterFocus Ltd	91197-00	Student range forceps
Gas Disperson Tube, Porosity 3	Merck	12547866	N/A
Glucose anhydrous, powder	VWR International Ltd	101174Y	500 g in plastic bottle
Grippers	N/A	N/A	Standard wet laboratory rod-mounted grippers
Heating Stirrer	RS UK	768-9672	Stuart US152
Hemostats	N/A	N/A	Any hemostat >12 cm in length is suitable
Insect Pins, stainless steel, size 2	InterFocus Ltd	26001-45	N/A
Laptop computer	N/A	N/A	Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable
Line Noise Filter	Digitimer	N/A	Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter)
Low-Noise Preamplifier, SR560	Stanford Research Systems	SR560	Low-noise voltage preamplifier
Magnesium Sulphate salt	VWR International Ltd	291184P	500g in plastic bottle
MATLAB scripts	Github	https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch	Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator
MATLAB software	Mathworks	N/A	Standard package
Microscope Light, PL-2000	Photonic	N/A	Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier
Microscope, SMZ 745	Nikon	SM745	Stereoscopic Microscope
Mineral oil, non-toxic	VWR International Ltd	31911.A1	Oil for nerve bath
Nerve Bath	N/A	N/A	Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details.
Oscilloscope	LeCroy	N/A	434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers
Oxygen Hose, 1 meter	BOC	N/A	1/4" NPT terminations
Oxygen Regulator	BOC	C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar	N/A
Peristaltic Pump P-1	Pharmacia Biotech	N/A	Product may be obtained from third party supplier
Petri Dish, Glass	VWR International Ltd	391-0580	N/A
Potassium Chloride salt	Sigma Aldrich	P5405-250g	250 g in plastic bottle
Potassium Dihydrogen Sulphate salt	Merck	1.04873.0250	250 g in plastic bottle
Rat	Charles River Laboratories	N/A	Sprague Dawley, 250-330 grams, female
Reference electrode, ET072	eDaQ (Australia)	ET072-1	Silver silver-chloride reference electrode
Rod	N/A	N/A	Standard wet laboratory rods with fittings for stands
Scale	Sartorius	N/A	M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers
Scissors straight 12 cm edge	InterFocus Ltd	91400-12	blunt-blunt termination, student range
Signal Acquisition Device	Cambridge Electronic Design	Micro3-1401	Micro3-1401 Multichannel ADC
Silicone grease, non-toxic	Farnell	3821559	for sealing of bath partition
Silicone tubing, 2 mm inner diameter	N/A	N/A	N/A
Silicone tubing, 5 mm inner diameter	N/A	N/A	N/A
Silver wire	Alfa Aesar	41390	0.5 mm, annealed
Sodium Bicarbonate salt	Sigma Aldrich	S5761-500g	500 g in plastic bottle
Sodium Chloride salt	VWR International Ltd	27810.295	1 kg in plastic bottle
Spring scissors angled 2 mm edge	InterFocus Ltd	15010-09	N/A
Stand	N/A	N/A	Standard wet laboratory stands with sockets for rods
Stimulator	Digitimer	DS3	DS3 or Custom Stimulator (see references)
Stirring flea	VWR International Ltd	442-0270	For use with the heating stirrer
Syringe tip, blunt, 1 mm diameter	N/A	N/A	N/A
Syringe tip, blunt, 2 mm diameter	N/A	N/A	N/A
Syringe, plastic, 10 mL volume	N/A	N/A	syringe should have luer lock fitting
Tape, water-resistant	N/A	N/A	For securing tubing and wiring to workbench
Thermometer	VWR International Ltd	620-0806	glass thermometer
USB Power Bank	RS UK	135-1000	Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3
Valve, Leuer Lock, 3-Way	VWR International Ltd	229-7440	For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon